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近年来，由于广谱抗生素、免疫抑制剂及化疗药物的应用，临床上肠功能紊乱患者众多，全球艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）发病率不断上升，目前已经超过耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，成为院内感染常见病原体[1]。CDI患者菌株主要为RT046（ST35）、RT017（ST37）和RT012（ST54），但是2007年在北美和欧美国家发现超毒力菌株027／NAPl／BI型，重症患者及死亡率明显增加，给CDI 的诊治带来了新的挑战[2]。艰难梭菌致病主要影响因素为菌株的毒力和患者免疫力，早期诊治能明显改善预后降低死亡率[3]。T淋巴细胞亚群检测是临床评估免疫功能的常用技术，能较好地反映CDI患者细胞免疫状况。本研究通过分析比较CDI患者与同龄健康人的T淋巴细胞亚群水平，探究CDI患者外周血T淋巴细胞亚群的临床意义，以更精准地指导CDI 的防治。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月～2020年2月在赣南医学院第一附属医院治疗的31例CDI患者为观察组，选取同期正常体检者32例为对照组。观察组中，男18例，女13例；年龄26～88岁，平均（62.1±10.3）岁。对照组中，男15例，女17例；年龄27～85岁，平均（45.84±6.77）岁。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①所有患者符合《中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识》[4]中的CDI诊断标准，即患者出现中至重度腹泻或肠梗阻，并满足以下任一条件，a.粪便检测艰难梭菌毒素或产毒素艰难梭菌结果阳性，b.内镜下或组织病理检查显示伪膜性肠炎。②所有研究对象均知情同意。排除标准：①近1月内系统应用激素或免疫抑制剂者；②近1 周内系统应用生物制剂者。根据CDI 严重程度，将观察组分为轻中度感染组（14例）和重度感染组（17例），分级标准[4]：轻中度感染，CDI患者有腹泻等肠炎样症状，但没有重度感染表现；重度感染，CDI患者有腹泻且存在以下任何一项因CDI 导致的异常，a.白细胞＞15×109/L，b.血肌酐较基线升高＞50%，c.内镜发现伪膜。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

流式细胞仪检测：空腹状态下采集两组3～4 mL外周静脉血，采集及转运时应避免震荡，静置于室温20℃下保存待用，分别取20 Μl CD8-PE/CD3-FITC/CD4-APC 试剂[生产厂家：上海汇中细胞生物科技有限公司生物医疗；批准文号：沪食药监械（准）字2011第5513-40-2011]，取50 μL EDTA 抗凝静脉血分别于试管中与之混匀，静置22℃室温的暗室孵育10～15 min，然后加入稀释后的流式溶血剂450 μL 充分混匀，静置22℃室温的暗室孵育10～15 min，上机检测并分析CD3+、CD4+、CD8+水平等T淋巴细胞亚群重要指标。

ELISA 检测艰难梭菌毒素A/B：在血琼脂培养基上接种艰难梭菌分离株，于35°C 厌氧培养48 h。将培养出的菌落挑出加入水中，可见菌落悬浮水面，接种悬浮菌液，离心。两组样品稀释液中加入离心后的上清混匀。在孔板检测盒对应的位置分别滴入阴性、阳性质控品。室温孵育结束后，孔板洗板机清洗3遍；所有孔中滴酶标液，室温孵育。洗板机上清洗5遍，所有孔中加滴显色底物，室温孵育结束后在加入滴终止液，以轻度震荡后充分显色为限。如为无色则为阴性；如为淡黄色至黄色则为阳性。

1.3 观察指标

比较观察组和对照组T淋巴细胞亚群水平，包括CD3+、CD4+、CD8+细胞水平，并比较对照组、轻中度感染组和重度感染组外周血T淋巴细胞表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t 检验，不符合正态分布者转换为正态分布后统计学分析；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

观察组患者的CD3+、CD4+、CD8+细胞水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

轻中度感染组及重度感染组患者外周血T淋巴细胞表达水平的比较，重度感染组患者的CD4+、CD8+细胞水平低于轻中度感染组，差异有统计学意义（P＜0.05）；轻中度感染组及重度感染组CD3+细胞水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

对照组与轻中度感染组T淋巴细胞亚群水平比较，轻中度感染组的CD3+、CD4+、CD8+细胞水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组与重度感染组T淋巴细胞亚群水平比较，重度感染组的CD3+、CD4+、CD8+细胞水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 T淋巴细胞亚群水平的比较（%，

±s）

3 讨论

淋巴细胞是人体重要的免疫细胞，占外周血白细胞总数的20%～45%，主要分为T细胞、B细胞和NK细胞三大类。根据细胞表面标志及功能特征，将淋巴细胞亚群分为CD3+、CD4+辅助性T细胞，CD8+的细胞毒性T细胞，CD19+ B细胞，CD16+、CD56+ NK细胞。CD3+细胞代表是外周血T细胞总量，作为T细胞的识别单位，参与特异性抗原识别。T细胞的辅助细胞和抑制细胞的诱导亚群的表面分布着CD4+细胞，协助细胞免疫及体液免疫反应。CD8+细胞包含两种类型，Ts细胞和Tc细胞。分布于杀伤性T淋巴细胞表面的Tc细胞可通过激活细胞因子分泌穿孔素、颗粒酶等引起靶细胞的破坏和凋亡，分布于抑制性T淋巴细胞表面的Ts细胞通过释放可溶性介质下调细胞和体液免疫反应[5-7]。人体细胞免疫功能的强弱与CD3+、CD4+、CD8+细胞水平变化呈正相关，随着细胞免疫功能的降低CD3+、CD4+、CD8+细胞水平也出现不同程度的下降。

本研究结果显示，观察组的CD3+、CD4+、CD8+细胞水平低于对照组（P＜0.05）。分析原因可能是CDI患者机体中存在严重免疫调节性功能障碍、抑制或紊乱，既往关于CDI 的危险因素的研究中认为“长期使用抗生素、长期住院、高龄、炎症性肠病、免疫功能低下者及糖尿病”是CDI 的危险因素[8-11]，其次可能为艰难梭菌感染后的疾病状态激活免疫系统，导致CD3+、CD4+、CD8+细胞水平下降。

艰难梭菌的致病机制是肠道黏附和繁殖产生毒素，从而对肠道粘膜产生病理作用。艰难梭菌产生毒素A（Tcd A）和毒素B（Tcd B），两者均能灭活GTP 结合蛋白，引发一系列反应最终导致腹泻和肠炎。艰难梭菌的毒力和宿主肠道微生物群及免疫反应是CDI严重程度的最主要因素[12-14]。本研究结合诊断标准将观察组患者分为轻中度感染组及重度感染组，发现重度感染组的CD4+、CD8+细胞水平低于轻中度感染组（P＜0.05），CD3+细胞水平无明显差异。可能是由于CD4+、CD8+细胞水平低下时，无法清除艰难梭菌和分泌足够的抗体中和艰难梭菌产生的Tcd A 和Tcd B，导致毒素对肠粘膜损害及引起肠道菌群失调，因此引起重度临床症状[15]。另外，在有关乙型肝炎病毒与淋巴细胞亚群相关研究中发现CD4+、CD8+细胞参与了病毒清除，并且起到关键作用[16-17]。在CDI患者病程中，CD4+、CD8+细胞数量可能与疾病严重程度呈负相关，由于CD4+、CD8+下降引起免疫功能下降，无法清除病原体，进一步导致感染的加重。但是由于本研究样本量小，仍需要进一步研究验证。国外研究者发现提高CDI患者的自身免疫力，也是主要辅助治疗手段之一，研究者将免疫球蛋白注入患者体内，引起免疫反应，结果发现治愈率较对照组高[18-19]。

综上所述，CDI患者具有明显的细胞免疫抑制作用，检测T淋巴细胞亚群水平可用于监测患者的免疫状况和评估患者的状况。患者感染程度不同，CD4+、CD8+细胞水平不同，严重感染者下降的趋势最为明显。加强临床中T淋巴细胞亚群的检测可以为CDI患者的临床免疫治疗和预后评估提供重要的临床依据。

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