结核性胸腔积液属于肺结核常见类型的一种，诊断难度大，临床上通常难以准确地将其与恶性胸腔积液进行鉴别[1-2]。既往，临床上通常将病史、影像学检查、临床表现、胸腔积液常规检查等作为诊断及鉴别该病的常用方式，但其准确率较低，极易造成漏诊或误诊。如何提高结核性胸腔积液的诊断准确率一直是临床关注的重点[3]。现阶段，临床上通常将结合分枝杆菌（MTB） 作为诊断结核性胸腔积液的金标准，然而，该诊断方式需要花费较长时间进行标本培养，及时性较差；而胸膜病理学检测虽然具有较高的特异性，然而其创伤性较大，故而难以被广大患者接受[4-5]。近年来，随着研究的深入，临床上逐渐将结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）应用于结核性胸腔积液患者的诊断中，该诊断方式属于细胞学检测技术的一种，对于T淋巴细胞反应具有较高的灵敏度。基于此，本研究选取深圳恒生医院收治的80例不明原因胸腔积液患者作为研究对象，探讨胸腔积液和外周血T-SPOT.TB检测对结核性胸腔积液的诊断价值，现报道如下。

选取2017年1月～2018年12月深圳恒生医院收治的80例不明原因胸腔积液患者作为研究对象，其中男46例，女34例；年龄26～77岁，平均（57.9±5.9）岁；发病至检查时间4 d～3个月，平均（11.9±1.3）d。以检测结果呈阳性者为结核性胸腔积液组，以金标准检测结果成阴性者为非结核性胸腔积液组，所有患者均留取胸水及外周血标本。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。纳入标准：①患者均知晓本次研究内容与风险，并经慎重考虑后自愿签署知情同意书；②患者精神正常，具有正常认知能力与沟通交流能力，能够正常配合研究；③患者均为单侧胸腔积液；④患者临床资料均完整，且中途均未退出研究。排除标准：①胸腔积液性质为漏出液者；②合并人类免疫缺陷病毒者；③合并恶性肿瘤者；④合并急性病毒感染及其他严重感染者；⑤合并严重慢性疾病者；⑥具有结核病史及结核病接触史者；⑦有免疫抑制剂用药史者；⑧妊娠期及哺乳期女性；⑨因精神疾病或意识障碍不能配合研究者。

1.2.1 样本采集 ①外周血单个核细胞（PNMCs）的分离及收集。分别取研究对象的外周血8～10 mL，以肝素钠进行抗凝处理，然后将其加至淋巴细胞分离液上层，行离心分离处理，常温下进行，离心速率为3000 r/min，离心20 min；然后以毛细滴管将中间白膜层吸除，以PBS 洗涤液离心细胞2～3次，之后于显微镜下行细胞计数，并以无血清1640 培养基进行细胞浓度调整，直至3×105/mL。②胸腔积液中PNMCs 的分离及收集。取患者胸腔积液8～10 mL，以肝素钠进行抗凝处理；然后按照上述操作方式进行处理，提取细胞。

1.2.2 T-SPOT.TB检测方法 取96 孔板，将其以抗INFr 单抗处理，然后按照阴性对照、结合抗原（ESAT-6/CFP-10 融合蛋白）、阳性对照孔顺序对采集的每份标本进行处理；将制备好的细胞悬浊液加入相标本中，悬浊液溶剂为100 μL，然后将标本置于5%CO2 培养箱中进行孵育过夜，培养箱温度控制为37℃，并以PBS 洗板4次。在标本中分别加入新鲜配置的酶表抗体工作液，然后进行为期1 h 的孵育，并以PBS 进行4次洗板。然后加入底物工作液，并以蒸馏水进行冲洗，终止反应。然后以ELISPOT 计数仪对每个孔中斑点情况进行计数，并以试剂说明为依据进行结果判定；以测量孔内菌素含量超过阴性对照孔的2 倍以上，或较阴性对照孔多5个斑点以上即为阳性；若未达到上述标准，同时质控对照孔正常时则为阴性。

以《中国结核病防治实施工作指南》[6]为依据进行结核性胸腔积液判定，并将其作为诊断金标准：①胸水或胸膜活检组织培养结果可见结核分枝杆菌；②胸膜活检病理显示干酪样肉芽肿；③胸水或胸膜活检组织结核分枝杆菌DNA 检测结果呈阳性。

分析外周血及胸腔积液T-SPOT.TB检验的诊断价值。①比较结核性胸腔积液组与非结核性胸腔积液组外周血及胸腔积液T-SPOT.TB检测阳性率、检测结果阳性组患者外周血及胸腔积液T-SPOT.TB 阳性率、ADA 检测阳性率。ADA 采用全自动生化分析仪检测，以ADA 水平＞45 U/L 为阳性；②比较胸腔积液及外周血T-SPOT.TB检测对结核性胸腔积液患者的敏感性、特异度、阳性预测值及阴性预测值。其中敏感性=真阳性/（真阳性+假阴性）例数/总例数×100%，特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）例数/总例数×100%，阳性预测值=真阳性/（真阳性+假阳性）例数/总例数×100%，阴性预测值=真阴性/（真阴性+假阴性）例数/总例数×100%。

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

所有患者经金标准检测结果呈阳性者47例，以此作为结核性胸腔积液组，检测结果呈阴性者33例，以此作为非结核性胸腔积液组。

结核性胸腔积液组患者外周血及胸腔积液TSPOT.TB 阳性率、ADA 检测阳性率均高于非结核性胸腔积液组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结核性胸腔积液组患者胸腔积液T-SPOT.TB检测阳性率高于外周血T-SPOT.TB检测阳性率，差异有统计学意义（χ2=4.43，P=0.041）。胸腔积液T-SPOT.TB检测阳性率、外周血T-SPOT.TB检测阳性率均高于ADA 检测阳性率，差异有统计学意义（χ2=7.05、18.13，P=0.008、0.000）（表1）。

表1 胸腔积液与外周血T-SPOT.TB检测阳性率的比较[n（%）]

胸腔积液T-SPOT.TB检测诊断结核性胸腔积液患者的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值均高于外周血T-SPOT.TB检测，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2～3）。

表2 胸腔积液及外周血T-SPOT.TB检测结果（n）

表3 胸腔积液及外周血T-SPOT.TB检测诊断价值的比较[n（%）]

胸腔积液为呼吸内科常见疾病的一种，其主要临床特征为胸膜内病理性积液聚集[7]。胸膜腔能够在人们呼吸运动时发挥润滑功效，每天有500～1000 mL 的液体在胸膜腔内形成、吸收，若胸膜腔内液体产生增多或吸收减少，则可引发胸腔积液[8-9]。结核性胸腔积液为胸腔积液的一种常见类型，主要因结核分枝杆菌及其产物进入胸膜腔所致，为肺外结核病的一种，具有起病急、病情严重等特点。发病后患者多可见发热、食欲不振、盗汗、乏力等症状，严重者还可见程度不同的胸痛、呼吸困难、干咳等症状，严重影响患者健康及正常生活，甚至可导致患者死亡[10]。因此，及时明确诊断，予以患者有效治疗非常必要。

既往，临床上通常将ADA 升高作为诊断结核性胸腔积液的一项重要参考依据，然而在与其他感染性胸腔积液、肿瘤性胸腔积液等进行区分时难度较大，易引发漏诊或误诊[11-12]。本研究结果显示，结核性胸腔积液组胸腔积液T-SPOT.TB检测阳性率、外周血TSPOT.TB检测阳性率均高于ADA 检测阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05），提示ADA 升高在结核性胸腔积液诊断中的应用价值仍有待提升。开胸即胸腔镜下胸膜活检虽然能够进一步提高诊断的准确性，但其创伤性较大，且操作风险及费用均相对较高，尚难以被广大患者接受，故限制了其在基层医院的应用与推广。近年来，随着医疗技术的发展及临床检验技术的进步，临床上逐渐将酶联免疫斑点法检测病患外周血中抗结核特异性T淋巴细胞的数量，即T-SPOT.TB应用于该病患者的诊断中，有研究指出T-SPOT.TB是检测T淋巴细胞反应的一种较为灵敏的方式[13]。T-SPOT.TB 是一种运用IGRA 技术，对被结核分枝杆菌特异的早期分泌靶抗原6 及培养滤液蛋白10分别刺激后释放γ-干扰素的效应T淋巴细胞进行检测的一种检测技术，其中早期分泌靶抗原6 及培养滤液蛋白10 均可作为刺激抗原，对外周血或胸腔积液来源的单个核细胞产生刺激，若机体伴有结核感染的特异效应T细胞，则在经受刺激抗原刺激后便会增加细胞因子γ-干扰素的释放量，从而可达到间接测定特异的效应T细胞数目、证实机体存在结核感染的效果。该检测方式可以对每个活化的结核特异效应T细胞进行记录，可在结核病及疑似结核病患者中广泛应用。有学者指出，T-SPOT.TB检测对于胸腔积液来源的单个核细胞的诊断价值相对于外周血及胸水、腹水等其他体液而言更高[14]。也有学者以T-SPOT.TB检测技术对胸腔积液患者外周血及胸腔积液单个核细胞进分别进行了检测，结果显示该检测方式对于胸腔积液的敏感性高于外周血[15]。本研究结果显示，结核性胸腔积液组患者胸腔积液T-SPOT.TB检测阳性率高于外周血T-SPOT.TB检测阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）；胸腔积液T-SPOT.TB检测诊断结核性胸腔积液患者的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值均高于外周血T-SPOT.TB检测，差异有统计学意义（P＜0.05），与既往研究结果相符，提示与外周血比较，胸腔积液单个核细胞检测的敏感性更高，具有更高的推广应用价值。

综上所述，T-SPOT.TB检测技术对结核性胸腔积液患者有较高的诊断意义，且其对于外周血或胸腔积液的单个核细胞的诊断结果均可作为结核性胸腔积液的有效参考指标，但与外周血来源的单个核细胞比较，胸腔积液来源的单个核细胞的诊断敏感性、特异性更高。由于本研究中所选取的样本量较小，故而临床上仍需选取更大的样本量，开展更为深入的研究，以期为胸腔积液和外周血T-SPOT.TB检测对结核性胸腔积液诊断价值的评估提供更为科学的参考。

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Diagnostic value of T cell spot test of tuberculosis infection of pleural effusion and peripheral blood in tuberculous pleural effusion

DENG Ai-feng1 ZHANG Guang-hui1 LAI min2
1.Department of Laboratory,Shenzhen Hengsheng Hospital,Guangdong Province,Shenzhen 510180,China;2.Department of Respiratory Redicine,Shenzhen Hengsheng Hospital,Guangdong Province,Shenzhen 510180,China

[Abstract]Objective To explore the diagnostic value of T cell spot test of tuberculosis infection (T-SPOT.TB) of pleural effusion and peripheral blood in tuberculous pleural effusion.Methods A total of 80 patients with unexplained pleural effusion who were admitted to Shenzhen Hengsheng Hospital from January 2017 to December 2018 were selected as the research objects.Peripheral blood and pleural fluid samples were collected from patients,and mononuclear cells were separated with sterile Ficoll lymphocyte fluid,T-SPOT.TB was performed,and the test results were analyzed.Those with positive test results of gold standard were tuberculous pleural effusion group,and those with negative test results were non-tuberculous pleural effusion group.The diagnostic value of T-SPOT.TB test in peripheral blood and pleural effusion were analyzed.Results There were 47 cases with positive results and 33 cases with negative results according to gold standard.The positive rates of T-SPOT.TB and Adenosine Deaminase (ADA) in pleural effusion and peripheral blood in tuberculous pleural effusion group were higher than those in non-tuberculous pleural effusion group,and the differences were statistically significant (P＜0.05).The positive rate of T-SPOT.TB detection in patients with tuberculous pleural effusion group was higher than that in peripheral blood,and the difference was statistically significant (P＜0.05).The positive rates of T-SPOT.TB detection in pleural effusion and peripheral blood were higher than that of ADA detection,and the differences were statistically significant (P＜0.05).The sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of T-SPOT.TB test in the diagnosis of tuberculous pleural effusion were higher than those of T-SPOT.TB test in peripheral blood,and the differences were statistically significant (P＜0.05).Conclusion The detection of T-SPOT.TB in peripheral blood and pleural effusion can be used as an auxiliary means for the diagnosis of tuberculous pleural effusion,but compared with peripheral blood,the detection of mononuclear cells in pleural effusion is more sensitive and can be widely used in clinic.

[Key words]Pleural effusion;Peripheral blood;T cell spot test of tuberculosis infection;Tuberculous pleural effusion

[基金项目]广东省深圳市宝安区科技计划基础研究项目（2018JD227）

（收稿日期：2020-02-17）