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中药酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa （Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子，在我国河北、山东、河南、辽宁、陕西、山西、甘肃等省都有出产[1]。味酸、甘，性平，归心、肝、胆经，具有补肝养心，宁心安神，生津，敛汗的功效，常用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等证[2]，是传统的安神中药，又是药食同源的品种。现代研究显示，酸枣仁中主要含有三萜类、黄酮类、生物碱、氨基酸等化学成分[3-4]。三萜类成分包括酸枣皂甙A、酸枣皂甙B、白桦脂酸、白桦脂醇、美洲茶酸等，酸枣仁皂甙A、酸枣仁皂甙B 具有明显的降血压、抗焦虑、抗心肌缺血、治疗神经衰弱等作用[5-10]。黄酮类主要成分为斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素，斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素是镇静、抗抑郁、催眠等作用的有效成分之一，酸枣仁皂甙和斯皮诺素作为治疗抑郁、失眠有效成分已被广泛应用于睡安口服液、酸枣仁滴丸、复方枣仁胶囊、枣仁安神胶囊和天仁安眠颗粒等成药制剂中[11-12]。目前文献报道对酸枣仁的研究主要集中在生药、生饮片和蜜炙酸枣仁[13-20]，在中医临床上应用较多的是炒酸枣仁饮片，但有关炒酸枣仁饮片的研究报道较少。本实验建立了以超高效液相色谱（UPLC）-紫外（UV）-蒸发光散射检测法（ELSD）测定不同产地炒酸枣仁饮片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素含量的方法，可为制定炒酸枣仁饮片质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Waters Acquity UPLC 色谱系统（四元高压梯度泵、自动进样器、真空脱气机、柱温箱、紫外检测器、蒸发光检测器）；Empower 色谱工作站；ME204E型十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；Mettler AG285 十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多集团）；KQ-500E型医用超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Hei-VAP Advantage 旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）。

1.2 试药及试剂

酸枣仁皂苷A 对照品（批号110734-200509）、酸枣仁皂苷B 对照品（批号110814-200404）购于中国食品药品检定研究院；斯皮诺素对照品（批号20120421）、6′′′-阿魏酰斯皮诺素对照品（批号20120513）均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98%。

酸枣仁样品购自我国河北省、山西省、山东省、河南省、辽宁省、陕西省、甘肃省，经南京中医药大学药学院潘金火教授鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa （Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子。分别取净酸枣仁按2015年版《中华人民共和国药典》酸枣仁饮片制法项下制得各产地相应的炒酸枣仁饮片[2]。炒酸枣仁产地、来源和批号见表1。

甲醇、甲酸、乙腈为色谱纯，水为自制高纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 炒酸枣仁产地、来源和批号

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ACQUITY C18 柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～4 min，85.5%～84%A；4～5 min，84%～80%A；5～9 min，80%A；9～11 min，80%～63% A；11～17 min，63% A；17～19 min，63%～0%A；19～22 min，0%A；22～24 min，0%～85.5%A；24～27 min，85.5% A。流速0.3 mL/min，进样量3 μL，柱温35℃。ACQ-TUV 检测波长335 nm，ACQ-ELSD 检测器：增益100，喷雾器为加热模式，动力级别50%；ELSD条件气压172 kPa，漂移管温度60℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液的配制分别精密称取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素对照品适量，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。分别精密量取单个组分对照品溶液，加甲醇配成每1 mL 分别含酸枣仁皂苷A 0.4352 mg、酸枣仁皂苷B 0.2008 mg、斯皮诺素0.4220 mg、6′′′-阿魏酰斯皮诺素0.3900 mg 的混合对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的配制取净酸枣仁按《中华人民共和国药典》[2]酸枣仁饮片制法项下制得炒酸枣仁饮片，粉碎，过三号筛，取粉末1.0 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL 70%乙醇，超声提取90 min，过滤，滤渣用70%乙醇洗涤，合并滤液和洗液，将合并后的滤洗液用旋转蒸发仪旋干乙醇，将干燥的浸膏置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（孔径为0.22 μm）过滤，所得的滤液作为供试品溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的配制精密吸取上述混合对照品储备液2.5 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，重复此操作再连续稀释1次，最终使酸枣仁皂苷A分别为435.2、217.6、108.8、54.4、27.2 μg/mL；酸枣仁皂苷B分别为200.8、100.4、50.2、25.1、12.6 μg/mL；斯皮诺素分别为422.0、211.0、105.5、52.8、26.4 μg/mL；6′′′-阿魏酰斯皮诺素分别为390.0、195.0、97.5、48.8、24.4 μg/mL。

2.3 专属性试验

分别取供试品溶液、混合对照品溶液各3 μL，按“2.1”项色谱条件，注入超高效液相色谱仪中，色谱图见图1。结果：酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素分离良好，在各出峰处均无干扰，表明该方法的专属性良好。

2.4 标准曲线及线性范围

按“2.1”项色谱条件，各对照品溶液分别进样3 μL，重复2次，酸枣仁皂苷A 和酸枣仁皂苷B 以对照品浓度的对数为横坐标（X），ELSD 检测峰面积的对数为纵坐标（Y），进行线性回归；斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素以对照品浓度为横坐标（X），UV检测峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得到各对照品回归方程、相关系数和线性范围（表2）。

2.5 精密度试验

精密吸取上述对照品溶液3 μL，按“2.1”项色谱条件，在1 d 内连续进样，记录峰面积，结果酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素的日内峰面积相对标准偏差（RSD）值分别为2.73%、2.93%、1.72%、1.88%；在3 d 内每天连续进样6次，记录峰面积，结果酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素的日内峰面积RSD值分别为3.14%、3.02%、2.53%、2.77%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一炒酸枣仁饮片（批号：HBDH180606）的样品粉末1.0 g，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样3 μL，进行测定，结果酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素的RSD值分别为2.81%、3.00%、2.41%、2.23%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

图1 炒酸枣仁的UPLC 色谱图

1：斯皮诺素；2：6′′′-阿魏酰斯皮诺素；3：酸枣仁皂苷A；4：酸枣仁皂苷B

表2 对照品的标准曲线、相关系数及线性范围

2.7 重复性试验

取同一炒酸枣仁饮片（批号：HBDH180606）的样品粉末1.0 g，精密称定，平行6份，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，计算酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素峰面积的RSD值，结果分别为2.73%、3.30%、2.33%、2.03%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的炒酸枣仁饮片（批号：HBDH180606）粉末0.5 g，精密称定，共9份，每3份一组，分别精密加入低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液（含酸枣仁皂苷A 0.1088 mg/mL、酸枣仁皂苷B 0.0502 mg/mL、斯皮诺素0.1055 mg/mL 和6′′′-阿魏酰斯皮诺素0.0975 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，计算加样回收率。平均回收率分别为100.01%、99.99%、100.00%、100.04%，相对标准偏差分别为0.17%、0.32%、0.32%、0.32%（表3）。

表3 加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定

取不同产地的炒酸枣仁饮片适量，粉碎，过三号筛，取粉末1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定4种成分的含量（表4）。

表4 不同产地炒酸枣仁中各成分的含量测定结果（n＝3，mg/g）

3 讨论

在选择提取条件时，本研究考察了甲醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇不同提取溶剂，结果以70%乙醇提取4种成分较完全。在选择提取方法时，考察了回流和超声两种提取方法，发现这两种方法提取效果相似，但超声提取节约时间、操作简便，故选择超声提取法。在选择提取时间时，考察了30、60、90 min不同提取时间，确定90 min时4种成分已基本提取完全。

本研究结果表明，不同产地炒酸枣仁中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素的含量存在差异，总体上河北产炒酸枣仁中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素含量相对较高，这与河北是酸枣仁道地药材产区一致，不同产地炒酸枣仁中药物有效成分含量差异的原因与产地的气候、土壤、光照和降雨量等环境因素、采收期及产地加工有关，或者采集批次太少，饮片存在个体差异所致。具体原因有待进一步研究。

2015年版《中华人民共和国药典》[2]仅要求对炒酸枣仁饮片的酸枣仁皂苷A、斯皮诺素作定量测定，而酸枣仁的产地较多，河北、山东、河南、辽宁、陕西、山西、甘肃均有出产，这造成药物成分和有效成分含量差异，所以仅检测酸枣仁皂苷A、斯皮诺素不能有效控制炒酸枣仁饮片质量，从而会影响炒酸枣仁相关产品的质量和临床疗效。本研究采用UPLC-UVELSD 法对炒酸枣仁饮片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素含量进行测定，并对不同产地炒酸枣仁饮片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素的含量进行比较，与中国药典中高效液相检测方法相比[2]，该方法准确、快速、重复性好，在20 min内完成检测，可作为评价炒酸枣仁饮片中酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素等成分的可靠分析方法，能更好地控制炒酸枣仁饮片质量，为制定炒酸枣仁饮片质量标准提供理论依据。

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