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胆囊癌是胆道系统中最常见的致命恶性肿瘤[1]。由于早期缺乏明显的症状与体征，因此大多数患者确诊时已发展到中晚期。最近有研究表明，我国胆囊癌患者初诊时超过1/2患者为Ⅳ期，根治性手术切除是提高可切除患者生存期最有效的方式[2-3]。胆囊癌早期易转移，对化学治疗及放射治疗具有免疫性，所以胆囊癌的5年生存率较低。因此寻找新的药物及治疗方式对于胆囊癌的治疗是非常有必要的。

华蟾素（Cinobufotalin）作为传统中药“蟾酥”的主要成分，是从中华大蟾蜍皮腺中提取的强心苷类化合物，具有强心、利尿、清热解毒等作用[4]。已有多项研究表明，华蟾素可对多种原发性肿瘤（如乳腺癌、前列腺癌、食管癌、成骨细胞瘤等）的临床或体外实验具有明显的抑制作用[5-8]。但尚未发现华蟾素对胆囊癌是否具有抑制作用。本研究探讨了华蟾素对胆囊癌GBC-SD细胞的抑制作用，并研究了相关作用机制，旨在对临床治疗提供基础资料和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

胆囊癌GBC-SD细胞株购自于中国科学院上海生命科学院细胞库。华蟾素（规格：5 mg，药物浓度：99.86%，化学分子式：C26H34O7，摩尔质量：458.54，识别码：1108-68-5），购于美国 MCE公司（Monmouth Junction，NJ，USA），并溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中制备华蟾素的储备溶液，在处理期间培养基中DMSO的最终浓度低于0.01%。DMEM培养液、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、青霉素/链霉素双抗溶液购买于美国Gibco公司。BCA蛋白定量试剂盒、细胞周期试剂盒均购买于上海碧云天生物科技有限公司。CCK-8、细胞凋亡检测试剂盒购自于上海翊圣生物科技有限公司。Transwell小室购自于美国Corning公司。兔抗人Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3（剪切型-caspase3）、Cleaved Caspase-9（剪切型 -caspase9）、Bcl-2、BAX、E-cadherin、N-cad herin、波形蛋白（Vimentin）及细胞周期蛋白 B1（cyclin B1）、CDK1蛋白抗体，均购自于美国Sant Cruz生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 GBC-SD细胞培养于含有10%FBS和1%双抗（青霉素、链霉素混合液）的完全培养基中，并培养在温度为37℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中。选取生长状态良好的、对数生长期的细胞进行后续体外细胞实验。

1.2.2 CCK-8细胞计数盒检测GBC-SD细胞增殖能力选取分裂状态良好的GBC-SD细胞进行细胞计数，以每孔2×103个细胞接种于96孔板中。过夜后更换为含有华蟾素的培养基，浓度分别为0、100、300、500、700、1000 nmol/L。每个浓度分别设置 24、48、72 h 三个时间组，并分别设置3个复孔。作用时间完成后，将培养基更换为含有CCK-8试剂的混合液，继续避光孵育2 h，然后在酶标仪450 nm处检测光密度值（optical density，OD）。细胞增殖率计算公式：细胞增殖率=（OD 处理组-OD 空白组）/（OD 对照组-OD 空白组）×100%。应用Graphpad Prism 7计算半数抑制浓度（IC50）。根据实验数据可得GBC-SD细胞IC50值为143.7 nmol/L左右，因此笔者IC50值上下设定实验浓度，分别为0、100、300、500 nmol/L。每项实验均独立重复3次。

1.2.3 平板克隆形成实验检测药物作用后的细胞增殖能力收集华蟾素（0、100、300、500 nmol/L）处理 48 h后的GBC-SD细胞进行细胞计数，以每孔500个细胞的密度接种于6孔板中，移液枪吹打均匀后置于培养箱中培养。每隔3 d更换1次新鲜完全培养基，培养10~15 d待细胞菌落形成后移除培养基。4%多聚甲醛溶液固定15 min后0.1%结晶紫染色20 min。清水清洗残余染料后，室温风干后进行拍照、计数。每项实验均独立重复3次。

1.2.4 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡收集不同浓度华蟾素（0、100、300、500 nmol/L）作用 48 h后的GBC-SD贴壁与悬浮细胞。离心沉淀后集合缓冲液重悬，并先后混合Annexin-Ⅴ-FITC和PI溶液，室温避光反应20 min后，与流式细胞仪下进行细胞凋亡检测。每项实验均独立重复3次。

1.2.5 流式细胞术实验检测细胞周期的变化收集按照上述实验方法处理后GBC-SD细胞，PBS洗涤离心沉淀以后，70%冰浴预冷的乙醇进行过夜固定。固定后冰浴预冷PBS进行洗涤细胞。预先缓和好的碘化丙啶溶液在37℃环境下进行避光孵育30 min。流式细胞仪检测华蟾素作用后的细胞周期变化。每项实验均独立重复3次。

1.2.6 Transwell小室实验将基质胶包被后的Transwell小室水化2 h后取出。收集华蟾素处理48 h后的GBC-SD细胞，并细胞计数。将细胞沉淀用无FBS的培养基进行稀释，并调整浓度为1×105个/ml，取20 μl细胞悬液接种于上室。在下室中加入含有10%FBS作为趋化剂的培养基。24 h后4%甲醛溶液固定20 min，棉签缓慢擦除未发生侵袭的上室细胞，并用结晶紫染色20 min。后清水缓慢冲洗残余染料，清水缓慢冲洗后显微镜下观察、拍照计数。每项实验均独立重复3次。

1.2.7 蛋白印迹实验检测相关蛋白表达量的变化收集不同浓度华蟾素处理48 h后的GBC-SD细胞，蛋白裂解液处理后提取总蛋白，提取后应用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，金属浴100℃加热10 min，充分变性蛋白。取20 μg/孔上样，行电泳蛋白分离，分离后应用湿转法将分离蛋白转移至PVDF膜上。TBST溶液稀释的5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜40 min。分别用按规定稀释后的Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Bcl-2、BAX、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH（内参蛋白）单克隆抗体工作液进行孵育，4℃恒温过夜。TBST溶液清洗3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG工作液室温孵育1 h，TBST溶液再次清洗3遍，每次10 min。Western Bright Sirius混合液与目的蛋白条带反应30 s后进行显色、拍照。每项实验均独立重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组之间比较分析采用独立样本t检验；多组之间比较先采用单因素方差分析，然后组内两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有高度统计学意义，以P＜0.001为有极其显著的统计学差异。

2 结果

2.1 CCK-8细胞计数实验、平板克隆形成实验检测不同浓度华蟾素对GBC-SD细胞增殖能力的影响

与空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L）比较，GBC-SD细胞的增殖能力随着时间和剂量的递增而下降，差异有统计学意义（P＜0.01）（图 1A，封三）。细胞克隆形成实验结果如图1B、C（封三）所示，随着用药浓度的增加（华蟾素浓度分别为 100、300、500 nmol/L），GBCSD细胞菌落数量明显减少，与空白无用药组（华蟾素浓度为 0 nmol/L）比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图1 CCK-8细胞计数实验、平板克隆形成实验检测不同浓度华蟾素对GBC-SD细胞增殖能力的影响（n=3）（见内文第29页）

与空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L）比较，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；A：CCK-8细胞计数图；B：不同浓度下的克隆实验菌落数量计数图；C：克隆形成实验图

2.2 华蟾素对GBC-SD细胞凋亡的影响

AnnexinⅤ-FITC/PI双染法结果见图2A所示，结果显示，华蟾素具有诱导GBC-SD细胞凋亡的能力（P＜0.001）。不同华蟾素浓度下的GBC-SD细胞生存率、早期凋亡率及晚期凋亡率情况见图2B，结果显示，随着用药浓度的增加（华蟾素浓度分别为100、300、500 nmol/L），GBC-SD 细胞生存率显著下降，GBC-SD细胞凋亡率（早期凋亡率与晚期凋亡率）显著上升（P＜0.001）。在华蟾素作用癌细胞48 h后，GBC-SD细胞在华蟾素浓度为100、300、500 nmol/L下的存活率分别为（75.63±2.13）%、（56.76±1.80）%、（46.13±1.12）%，与空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L）的存活率（87.83±0.71）%比较，存活率随着用药浓度的增加而降低，其差异有统计学意义（P＜0.05）。

凋亡相关蛋白印迹实验结果见图2C，结果显示，华蟾素可促进促凋亡蛋白Cleaved-PARP、Cleavedcaspase3、Cleaved-caspase9、BAX 的表达量，并降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量。不同华蟾素浓度下的Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Bcl-2、BAX蛋白表达量见图2D，结果显示，随着用药浓度的增加（华蟾素浓度分别为 100、300、500 nmol/L），各组Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、BAX 的表达量高于空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L），各组Bcl-2的表达量低于空白无用药组（华蟾素浓度为 0 nmol/L），差异有统计学意义（P＜0.01）。

图2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测华蟾素对GBC-SD细胞凋亡的影响、蛋白印迹实验检测凋亡相关蛋白的表达（n=3）

与空白无用药组（华蟾素浓度为 0 nmol/L）比较，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；A：AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞凋亡图；B：不同华蟾素浓度下的GBCSD细胞生存率、早期凋亡率及晚期凋亡率；C：凋亡蛋白印迹图；D：不同华蟾素浓度下的 Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Bcl-2、BAX 蛋白表达量

2.3 华蟾素对GBC-SD细胞的分裂周期的影响

流式细胞术（flowcytometry，FCM）实验结果见图3A。不同华蟾素浓度下GBC-SD细胞集聚在G0/G1、S、G2/M期的细胞比例情况见图3B，结果显示，随着用药浓度的增加（华蟾素浓度分别为 100、300、500 nmol/L），GBC-SD细胞集聚在G2/M期的细胞比例分别为（27.27±3.20）%、（49.20±2.09）%、（59.87±1.72）%，与空白无用药组（华蟾素浓度为 0 nmol/L）的（20.70±2.16）%比较，发现分布于G2/M期的细胞比例随着华蟾素用药浓度的增加而增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L）比较，分布于G0/G1期的细胞比例随着华蟾素用药浓度的增加而降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

周期相关蛋白印迹实验检测结果见图3C。不同华蟾素浓度下的G2/M期进展调节相关蛋白CDK1和Cyclin B1的表达量见图3D，结果显示，随着华蟾素用药浓度的增加（华蟾素浓度分别为100、300、500nmol/L），G2/M期进展调节相关蛋白CDK1和Cyclin B1的表达量均下降，与空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L）比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图3 FCM法检测GBC-SD细胞的分裂周期、蛋白印迹实验检测G2/M期相关蛋白的改变（n=3）

与空白无用药组（华蟾素浓度为 0 nmol/L）比较，aP＜0.05，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；A：FCM实验细胞周期分布图；B：不同华蟾素浓度下GBCSD细胞集聚在G0/G1、S、G2/M期的细胞比例情况；C：周期蛋白印迹图；D：不同华蟾素浓度下的G2/M期进展调节相关蛋白CDK1和Cyclin B1的表达量

2.4 华蟾素对GBC-SD细胞的侵袭能力的影响

Transwell小室实验结果见图4（封三）。不同华蟾素浓度下胆囊癌细胞穿过小室的数量在显微镜单视野下GBC-SD细胞数量见图5A，结果显示，随着华蟾素用药浓度的增高，在显微镜单视野下穿过小室的GBC-SD 细胞数量分别为（70.33±3.06）、（47.00±1.00）、（9.67±1.53），与空白无用药组（华蟾素浓度为 0 nmol/L）的（126.00±1.58）比较，侵袭细胞数量随着华蟾素用药浓度的升高而降低（P＜0.001）。

图4 Transwell小室实验检测华蟾素对GBC-SD细胞侵袭能力的影响（×500）（见内文第30页）

侵袭性相关蛋白印迹实验结果见图5B。不同华蟾素浓度下 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达量见图5C，结果显示，随着华蟾素用药浓度的增加（华蟾素浓度分别为 100、300、500 nmol/L），侵袭性抑制相关蛋白E-cadherin的表达量均高于空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L），促侵袭性相关蛋白N-cadherin、Vimentin的表达量低于空白无用药组（华蟾素浓度为0 nmol/L），差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图5 华蟾素对GBC-SD细胞侵袭能力的影响、蛋白印迹实验检测华蟾素对侵袭性相关蛋白表达的变化（n=3）

与空白无用药组（华蟾素浓度为 0 nmol/L）比较，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；A：不同华蟾素浓度下在显微镜单视野下穿过小室的GBC-SD细胞数量；B：侵袭蛋白印迹图；C：不同华蟾素浓度下 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达量

3 讨论

胆囊癌是胆道系统中常见的致命恶性肿瘤，由于早期不易发现，治疗手段较单一，肿瘤细胞转移及侵袭能力较强，因此5年生存率较低[2-3]。几千年来中医中药一直被广泛用于治疗各种疾病及疑难杂症，华蟾素为中药“蟾酥”的主要成分，且多项研究表明华蟾素具有抗肿瘤作用[5-8]，但尚无研究证明华蟾素在胆囊癌中是否具有抑制作用。

本研究针对华蟾素是否对人胆囊癌GBC-SD细胞具有抑制作用做了大量实验，并对相关作用机制进行了探索。为探索华蟾素对GBC-SD细胞的增殖是否具有抑制作用，笔者进行了CCK-8细胞计数实验和平板克隆形成实验，结果表明华蟾素对GBC-SD细胞有明显的抑制作用，并呈现时间和剂量依赖性。

诱导癌细胞的凋亡是许多肿瘤治疗手段的作用方式[9]。本研究应用流式Annexin-V-FITC/PI双染法实验，证明华蟾素可明显诱导胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡，并呈现出剂量依赖性，说明华蟾素具有促进GBC-SD细胞凋亡的作用。细胞凋亡分为死亡受体外途径与线粒体介导的凋亡内途径两种方式[10]。线粒体表面存在的Bcl-2家族蛋白，可改变线粒体外膜的通透性，来影响细胞色素C的释放。释放的细胞色素C可与细胞质中的相关因子相互作用，然后以级联模式激活caspase蛋白或分解相关特定的凋亡蛋白[11-14]。本研究中，华蟾素可通过上调Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白Bax，下调抑凋亡白Bcl-2的表达，引起caspase级联蛋白的改变，从而导致促凋亡蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9的表达量增加，引起细胞的凋亡。说明华蟾素可通过线粒体介导的凋亡内途径诱导GBC-SD细胞的凋亡。

细胞周期的阻滞被认为是肿瘤治疗的一种有效方式[15-16]。本研究进行了FCM实验，研究华蟾素对于胆囊癌GBC-SD细胞分裂周期的影响，实验结果显示，华蟾素可于G2/M期明显抑制GBC-SD细胞的分裂。笔者进一步对G2/M期进展相关蛋白CDK1和Cyclin B1进行了蛋白印迹分析，结果表明，华蟾素作用后，GBCSD细胞内CDK1和Cyclin B1蛋白表达量均显著下降。因此，本研究结果支持华蟾素也可通过阻滞胆囊癌细胞的分裂从而抑制肿瘤细胞增殖这一猜想。

肿瘤细胞的侵袭能力与患者的预后和生存率有着直接关系，为探索华蟾素是否具有抑制GBC-SD细胞侵袭的作用，本研究进行了Transwell小室实验，实验结果显示，华蟾素可明显的抑制GBC-SD细胞的侵袭能力。上皮-间质转化是肿瘤发生迁移及侵袭的主要机制之一，E-cadherin与N-cadherin的表达量是评价上皮-间质转化发生程度的重要指标[17]。E-cadherin在维持细胞黏附系统中发挥着重要作用，表达量的高低与细胞迁移及侵袭的能力呈反比，而N-cadherin的表达量的高低与细胞侵袭能力呈正比[18-19]。Vimentin蛋白主要与上皮组织中，过度表达会促进上皮细胞间连接的分解，与肿瘤侵袭能力的改变有着直接关系[20]。笔者发现，华蟾素提升E-cadherin的表达增强上皮细胞之间的黏附能力，降低N-cadherin与Vimentin的表达从而减小GBC-SD细胞的侵袭性。

综上所述，给研究表明华蟾素可抑制胆囊癌GBC-SD细胞的增殖、侵袭能力，并且可诱导其凋亡。该实验仅探讨了华蟾素对胆囊癌细胞的体外影响，如将华蟾素应用于临床，还需要更深一步的进行裸鼠异体成瘤实验和临床用药实验。

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