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缺血缺氧性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是常见的新生儿脑损伤性疾病，可引起患儿出现急性或慢性的神经功能损伤，是小儿致残及导致脑性瘫痪的主要病因[1]。HIE所导致的运动功能障碍长久存在，严重影响患儿的生存能力[2]。前期临床研究得出全身振动训练和中医电针治疗能通过调控NF-κB信号系统增高体内Bcl-2抗凋亡因子表达，减轻脑瘫患儿肌细胞的过度凋亡，提高患儿骨骼肌肌力，改善患儿运动功能障碍[3]。但造成骨骼肌肌力降低是否与肌细胞抗凋亡能力降低相关，是否可以通过调控骨骼肌内KF-κB信号通路减轻肌细胞凋亡来达到减轻患儿运动功能障碍的实验证据不足。本研究从NF-κB信号通路调控Bcl-2抗肌细胞凋亡的角度比较振动和电针治疗对HIE幼鼠神经行为评分、腓肠肌纤维组织形态及腓肠肌湿重占体重比，研究针对HIE幼鼠运动功能障碍的形成机制以及治疗机制，为临床HIE患儿的运动功能改善提供康复治疗实验依据，缩短康复治疗时间。

1.材料与方法

1.1 实验动物

实验动物由北部战区总医院动物实验中心提供，许可证号：SCKC（辽）2015-213，实验选取健康SPF级母带子鼠，不拘雌雄，母鼠旁喂养7 d，从中选取体重13~18 g的幼鼠120只。饲养条件如下：室温（23±2）℃，相对湿度 45%~60%，昼夜比为 1∶1，母鼠自由进食水。本研究经北部战区总医院实验动物伦理委员会审查批准，实验操作完全符合《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及干预方法将选取的120只7日龄健康SD幼鼠按照随机数字表法分成4组，每组30只，不拘雌雄。假手术组体重（15.8±2.4）g，不进行造模，仅在颈前正中稍偏左侧处作一长5~7 mm手术切口再逐层缝合切口，母鼠旁喂养不进行任何干预；其余三组HIE造模成功后放回母鼠旁喂养2周后，模型对照组体重（16.1±2.6）g，予每日捆绑 15 min 不做其他干预；振动治疗组体重（16.3±2.2）g，予幼鼠每日振动训练 1 次；电针治疗组体重（15.5±2.3）g，予每日电针治疗1次，所有干预和治疗均为15 min/次，1次/d，疗程为4周。

1.2.2 实验动物HIE模型制备方法 HIE脑损伤模型参照经改良Rice法建立[4]，予幼鼠10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，固定后在颈前正中稍偏左侧处作一长5~7 mm手术切口，逐层剥离找到左侧颈总动脉，对其进行结扎作1切口后进行逐层缝合，待幼鼠苏醒之后将其放置到透明密闭容器内，连接通入混合气体（8% O2和92% N2组成），流量1 L/min。并将容器放置到恒温（37℃）水浴中2 h，在完成建模 2 h后进行 Bederson神经行为学[5]评价，得分≥1分者为HIE模型建立成功。因未苏醒、死亡以及造模失败原因，模型对照组剔除2只幼鼠，振动治疗组及电针治疗组各剔除1只幼鼠。

1.2.3 治疗方法振动治疗：将幼鼠躯干部位固定于自制支架上，四肢放置到振动训练台上保持四肢站立位，调节振动频率为25 Hz、振幅为1.5 mm，15 min/次，1次/d，疗程为4周。电针治疗：取穴为患侧足三里、三阴交，参照《大鼠穴位图谱的研制》[6]对幼鼠进行针灸穴位定位：三阴交位于后肢内踝尖直上10 mm；足三里位于大鼠膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm。无菌针灸针规格：0.17×7 mm，两穴均直刺3 mm[7]。针刺完成后，留针并连接电针仪，调节电针刺激强度至周围肌肉组织出现微微颤动，具体参数：波形为疏密波，频率为7~10 Hz。所有治疗均为15 min/次，1次/d，疗程为4周。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 神经行为学Bederson评分测试在建模前、建模2周后及治疗后每组随机选取10只幼鼠根据Bederson评分标准进行神经行为学能力评价。0分别为正常；1分为轻度损伤，悬尾试验阳性，对侧前肢出现屈曲姿势，不能完全伸展；2分为中度损伤，侧向推力试验阳性，即前肢抵抗对侧推力能力下降，伴前肢屈曲，无转圈；3分为重度损伤，除上述症状外还伴转圈试验阳性，幼鼠自由活动时向对侧转圈。

1.3.2 腓肠肌湿重占体重比治疗结束后每组随机选取5只幼鼠，分别称重记录，10%水合氯醛腹腔麻醉，完整取出右后肢腓肠肌，用4℃预冷生理盐水洗净血液，滤纸吸干肌肉组织表面水分并称重，计算并记录腓肠肌占幼鼠体重比[腓肠肌湿重（g）/小鼠体重（g）×100%]。

1.3.3 腓肠肌纤维组织组织形态学改变治疗结束后每组随机选取5只幼鼠按上诉方法留取标本，取腓肠肌中段肌腹最大处肌组织块0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，固定于4%中性多聚甲醛中24 h，然后石蜡包埋切片5 μm，常规脱蜡，经苏木素及伊红染液中染色，将切片浸入乙醇中停留2 min，Lecia图像分析系统400倍下观察腓肠肌肌纤维组织形态改变情况并拍照。

1.3.4 免疫组化法分析腓肠肌细胞内Bcl-2 mRNA水平治疗结束后按上诉方法留取腓肠肌标本，所有标本均采用免疫组织化学法检测，具体操作完全按Bcl-2 mRNA免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）操作。应用image-pro plus生物图像分析系统测量染色阳性部位平均吸光度值。

1.3.5 采用 QT-PCR方法检测腓肠肌细胞内NF-κB基因表达水平治疗结束后取部分腓肠肌样品，RNA抽取步骤按照Trizol试剂盒说明书进行。取RNA样品5 μl，以oligo dT为随机引物进行反转录，合成cDNA。10 μl反应体系中含有：5×RT Buffer 2 μl，RT Enzyme Mix 0.5 μl，Primer Mix 0.5 μl，RNA 5 μl，Nucleasefree Water 2 μl。cDNA样品按以下反应体系进行：SYBRgreen PCR Master Mix（TOYOBO）10 μl，上下游引物各 0.8 μl，ddH2O 6.4 μl，cDNA 模板 2 μl。总反应体积 20 μl，建立聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）产物溶解曲线，变性、退火，从 55℃缓慢加热到95℃，每1摄氏度收集荧光一次。荧光定量PCR的要求为熔解曲线只有一个主波峰，PCR仪输出CT 值，β-actin 基因为内参[8]。1.4统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组幼鼠神经行为Bederson评分的比较

建模前，四组幼鼠的Bederson评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。建模2周后，模型对照组、电针治疗组与振动治疗组的Bederson评分高于假手术组，且高于本组建模前，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，电针治疗组与振动治疗组的Bederson评分均低于建模2周后，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，电针治疗组及振动治疗组的Bederson评分均低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，电针治疗组与振动治疗组的Bederson评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

表1 四组幼鼠神经行为Bederson评分的比较（分，

±s）

与本组建模前比较，aP＜0.05；与本组建模2周后比较，bP＜0.05；与假手术组同期比较，cP＜0.05；与模型对照组同期比较，dP＜0.05；“-”表示无数据

2.2 治疗后四组幼鼠腓肠肌肌纤维组织形态学改变

治疗后可观察到假手术组的腓肠肌组织结构正常，肌膜很清晰并且比较完整，肌纤维紧密的排列，肌横纹清晰、规则；模型对照组的腓肠肌肌纤维萎缩显著，肌纤维呈小群性分布，伴有大量结缔组织增生，提示存在肌纤维退变；治疗后振动治疗组及电针治疗组的肌纤维较模型对照组肌纤维排列紧密，肌横纹规则，其中振动治疗组肌纤维直径较模型对照组明显增粗，而电针治疗组的肌纤维细胞核明显增多，肌纤维排列更加紧密（图1，封三）。

图1 治疗后四组幼鼠腓肠肌肌纤维组织形态学改变（400×）（见内文第7页）

A：假手术组；B：模型对照组；C：振动治疗组；D：电针治疗组

2.3 治疗后四组腓肠肌湿重占体重比、Bcl-2 mRNA、NF-κB基因表达的比较

治疗后，模型对照组、电针治疗组与振动治疗组的腓肠肌湿重占体重比低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，振动治疗组与电针治疗组的腓肠肌湿重占体重比均高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；振动治疗组的腓肠肌湿重占体重比高于电针治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

治疗后可观察到Bcl-2 mRNA表达呈棕黄色颗粒均匀分布于腓肠肌细胞浆内。治疗后，模型对照组、振动治疗组及电针治疗组的Bcl-2 mRNA阳性表达和NF-κB基因表达均低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；振动治疗组及电针治疗组的Bcl-2 mRNA阳性表达和NF-κB基因表达均高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针治疗组的Bcl-2 mRNA阳性表达和NF-κB基因表达均高于振动治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 2，封四、表 2）。

表2 四组腓肠肌湿重占体重比、Bcl-2 mRNA、NF-κB基因比较（

±s）

与假手术组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与振动治疗组比较，cP＜0.05

3 讨论

HIE患儿所导致的运动障碍长久存在，表现为肢体活动减少，骨骼肌肌力下降，若不及时干预，会导致肢体的肌肉萎缩，关节挛缩，严重影响患儿的生活自理能力，故尽早实施快速有效的治疗，提高HIE患儿的运动能力十分重要[9]。有研究发现细胞凋亡是肌发生期间肌肉细胞数目、形状的主要调节者[10]，而肌纤维数目增多和肌纤维肌横截面积增粗形成骨骼肌肥大可提高骨骼肌肌力。在凋亡调控基因中Bcl-2/Bax系统起到非常重要的作用，Bcl-2可阻断活性氧自由基的形成，抑制氧自由基对脂质的氧化作用，从而起到抑制细胞凋亡的作用[11-12]，并且Bcl-2具有琥珀酸脱氢酶的活性，直接参与细胞增殖，促进非增殖细胞存活，延长细胞寿命[13]。Bcl-2基因上存在NF-κB信号位点，而Bax上则没有。NF-κB是一种多效性的转录因子，可以与多种启动子结合，参与调控多种基因的转录，其激活受氧化应激、细胞炎症因子等外界刺激影响，NF-κB的激活可引起Bcl-2抗细胞凋亡的基因表达增加[14]。

中医认为脾主四肢肌肉，水谷清阳之气由脾气输布，充养四肢。《黄帝内经·素问》记载：“四肢皆禀气于胃，而不得至经，必因于脾，乃得禀也[15]。”可见四肢的功能与脾和胃密切相关[16]。足太阴脾经三阴交及足阳明胃经足三里两穴，调补脾胃，充盈水谷清阳，强壮四肢筋骨，通过电针治疗对腧穴进行电刺激，调整小鼠体内的离子浓度和分布，加强骨骼肌细胞代谢和抗氧化等作用[17-18]，提高HIE幼鼠的运动协调能力。而振动治疗是一种新型快速提高肌肉力量的训练方法[19]，可利用机械振动和外在抗阻负荷刺激机体，激活神经肌肉牵张反射，促进骨骼肌肥大，从而有效改善神经肌肉功能[20]。

本研究结果显示，与假手术组比较，模型对照组幼鼠的腓肠肌内NF-κB基因、Bcl-2 mRNA表达降低，骨骼肌肌细胞纤维萎缩和退变，患侧腓肠肌湿重占体重比降低且Bederson评分增高，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示 HIE幼鼠 NF-κB基因调控Bcl-2抗凋亡水平降低可导致HIE幼鼠骨骼肌萎缩、运动功能障碍以及神经行为异常。而经过振动治疗和电针治疗的两组HIE幼鼠腓肠肌内NF-κB基因、Bcl-2 mRNA水平均高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），同时两组损伤的腓肠肌纤维较模型对照组纤维排列紧密，腓肠肌湿重占体重比高于模型对照组，肌萎缩情况改善，两组幼鼠Bederson评分低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中电针治疗组的NF-KB基因、Bcl-2 mRNA水平均高于振动治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），镜下可见电针治疗组肌纤维细胞核较振动治疗组增多，肌纤维排列更紧密，Bederson评分亦较振动治疗组有所降低，说明电针治疗较振动治疗可以更好地通过NF-κB基因调控Bcl-2表达，提高HIE幼鼠骨骼肌细胞抗凋亡能力，修复损伤肌纤维，提高HIE幼鼠的神经运动功能。而振动治疗组HIE幼鼠由于每日运动量较大，体重增长较少，故振动治疗组腓肠肌湿重占体重比较电针治疗组提高。

综上所述，通过NF-κB基因调控Bcl-2表达降低骨骼肌细胞抗凋亡能力是导致HIE幼鼠骨骼肌纤维损伤、肌肉萎缩及运动功能障碍的原因之一。而电针治疗较振动治疗可以更好地激活NF-κB调控Bcl-2抗凋亡表达，提高骨骼肌细胞的抗凋亡及增殖能力，修复肌细胞损伤，增加肌纤维数量，缓解肌肉萎缩，改善HIE幼鼠的运动功能障碍。本次研究不足之处是没有设立联合治疗组进行比较，临床上可以采用电针结合振动训练的方法进行康复治疗来达到更快速有效的治疗效果。

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Comparative study on the intervention mechanism of vibration and electroacupuncture on motor dysfunction in young rats with hypoxic-ischemic encephalopathy

QI Teng-che WANG Chun-nan▲ LI Hong
The Third Department of Neurological Rehabilitation,Shenyang Children′s Hospital,Liaoning Province,Shenyang 110032,China

[Abstract]Objective To compare the effect of whole-body vibration training and electroacupuncture on Bederson score,gastrocnemius muscle fiber morphology and gastrocnemius muscle wet weight ratio in young rats with hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE)from the perspective of Bcl-2 anti-myocyte apoptosis regulated by NF-κB,and to study the formation and treatment mechanism of motor dysfunction in young rats with HIE.Methods A total of 120 7-dayold healthy SD young rats were divided into 4 groups by random number table method.No modeling and any intervention were done in sham operation group.HIE model was made in the other three groups:the model control group was bound every day;the electroacupuncture treatment group was treated with electroacupuncture;the vibration treatment group was given vibration treatment for 4 weeks.Bederson scores,fibrous morphology,NF-κB gene and Bcl-2 mrna expression levels of gastrocnemius muscle were compared before modeling,2 weeks after modeling and after treatment.Results After 2 weeks of modeling,Bederson scores of model control group,electroacupuncture group and vibration group were higher than those of sham op-eration group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).After treatment,the Bederson scores of electroacupuncture treatment group and vibration treatment group were lower than those of model control group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).After treatment,there was no statistically significant difference in Bederson score between the electroacupuncture treatment group and the vibration treatment group(P＞0.05).After treatment,the wet weight of gastrocnemius in vibration treatment group and electroacupuncture treatment group were higher than that in model control group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The proportion of wet weight of gastrocnemius muscle in body weight in vibration treatment group was higher than that in electroacupuncture treatment group,and the difference was statistically significant(P＜0.05).After treatment,the gastrocnemius muscle fibers in the model control group shrank significantly and the muscle fibers degenerated,the muscle fibers in the vibration treatment group and electroacupuncture treatment group were closely arranged and the muscle transverse lines were regular versus those in the model control group,the nucleus of muscle fibers in the electroacupuncture treatment group increased significantly.After treatment,the positive expression of Bcl-2 mRNA and NF-κB gene in model control group,vibration treatment group and electroacupuncture treatment group were lower than those in sham operation group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The positive expression of Bcl-2 mRNA and NF-κB gene in vibration treatment group and electroacupuncture treatment group were higher than those in model control group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The positive expression of Bcl-2 mRNA and NF-κB gene in electroacupuncture treatment group were higher than those in vibration treatment group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Regulation of Bcl-2 expression by NF-κB gene for reduction of the anti-apoptotic ability of skeletal muscle cells is one of the reasons for skeletal muscle fiber injury,muscle atrophy and motor dysfunction in HIE young rats.Compared with vibration therapy,electroacupuncture can better activate NF-κB,regulate Bcl-2 anti-apoptotic expression,improve the anti-apoptotic and multiplication capacity of skeletal muscle cells,repair muscle cell damage,increase the number of muscle fibers,alleviate muscle atrophy and improve the motor dysfunction of HIE young rats.

[Key words]Hypoxic ischemic encephalopathy;Electroacupuncture treatment;Vibration therapy;NF-κB;Bcl-2