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骶髓损伤后神经源性膀胱指的是骶段脊髓病变、腰椎病变引起脊髓损伤导致损伤骶髓初级排尿中枢，或者是由于临近体神经与副交感神经病变导致的膀胱功能障碍，具体表现包括逼尿肌无反射，膀胱容量逐渐扩大，尿液无法正常排出[1]。这一膀胱功能障碍使膀胱组织细胞形态学出现病理层面的改变，可能继发尿路反复性感染，严重情况下还可能出现肾衰，被认为是脊髓损伤病死的主要原因[2]。因此针对骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留，需要重视改善其尿动力学状况，提高膀胱功能。中医将尿潴留纳入“癃闭”范畴，针灸作为中医传统疗法，被证实可对膀胱功能形成双相调节，还能有效抗泌尿系感染[3]。一项动物实验研究发现，对该病模型大鼠给予电针治疗能增强其逼尿肌兴奋程度，提高膀胱收缩张力，帮助膀胱排尿功能得以重建[4]。本研究选择30 只雄性SD 大鼠，分为三组后分析电针治疗的应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

10%水合氯醛，手术台，微型蚊式钳，眼科剪，庆大霉素（宜昌人福药业有限责任公司，国药准字H42022058），电针治疗仪（安阳市翔宇医疗设备有限责任公司，XYD-Ⅲ型，产品标准编号：YZB/豫0050-2009），F3 导管，微量灌注泵，多通道生理记录仪[ADInstruments POWERLAB，药（械）准字：20153212513]，Primer-BLAST，TRIzol 试剂（上海恪敏生物科技有限公司），反转录试剂盒[金克隆（北京）生物技术有限公司，规格：50T RE0510]，据蛋白质定量试剂盒（BCA）[北京库尔科技有限公司，批准文号：京药监械（准）字2011 第2400737 号]，5%脱脂奶粉（石家庄君乐宝乳业有限公司），Western 洗涤缓冲液（TBST）（上海联迈生物工程有限公司，货号：LM-2925）。

1.2 实验动物及分组

材料：选择30 只健康成年雄性SD 大鼠作为本研究材料，大鼠均为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级别，体重250～300 g，均采购于本地区实验动物中心，有正规实验动物使用许可证，许可证号：SYXK（赣）2020-0016。本研究整个动物实验过程均与动物伦理委员会标准相符合。

分组：按照随机数字表法选择其中10 只作为对照组，另外20 只建立骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留模型，建模成功后再将这20 只大鼠随机分为模型组（10 只）和电针组（10 只）。

1.3 方法

1.3.1 建模根据脊髓横断法进行模型制备，具体操作如下。选择10%水合氯醛行腹腔注射进行麻醉处理，将大鼠放置为俯卧位固定在手术台。骨性标志选定为连接第13 浮肋的T13，向上以此类推，完成T10 的定位，并进行备皮处理，碘伏消毒后于后正中线从T8 到T12 作纵向切口。将皮肤切开并逐层进行钝性分离处理，将T9 到T11 共3 个棘突以及横突暴露出来。将横突通过镊子夹住并固定，选择微型蚊式钳T10 椎板咬除，将2 mm 直径的脊髓暴露出来，迅速通过眼科剪将脊髓剪断，之后迅速能观察到大鼠两下肢有抽搐反应，尾巴会甩动，接着会彻底松弛。止血后将各层按顺序关闭，选择庆大霉素涂抹伤口。

1.3.2 建模成功标准建模24 h 之后能触及膀胱隆起，且脊髓损伤的行为学评分（Basso-Beattie-Bresnahan，BBB）评分[5]结果为0 分，前肢可行走，后肢处于拖动状态。本研究20 只大鼠均成功建模。建模后大鼠均保持单笼饲养，饲养温度恒定37℃，予其自由饮水、进食，每天按压其膀胱帮助其排尿以及排便，频率2～3 次/d，另外每天选择20 万U 青霉素进行腹腔注射进行伤口感染预防，持续使用1 周。

1.3.3 治疗对照组不给予治疗，模型组不给予治疗，电针组以次髎、三阴交以及中极为穴位进行针刺治疗，穴位定位：次髎穴处于第2 骶后孔部位直刺15 mm 左右，中极穴处于神阙穴与耻骨联合上缘连线的上4/5 与下1/5 的交点平刺5 mm，三阴交穴位处于后肢内踝尖直上方1 cm 部位直刺5 mm。电针刺激通过电针治疗仪进行，疏密波分别设置为10、50 Hz，相应工作5、9 s，以大鼠肢体轻微颤动为宜。针刺双侧次髎穴位时左侧与正极连接，右侧与负极连接，针刺中极穴位时与负极连接，针刺三阴交穴位时与正极保持连接，并且进行三阴交针刺时应该保持左右侧交替取穴。每天治疗1 次，每次治疗时间持续20 min，持续治疗1 周。

1.4 观察指标

采集及处理标本：所有大鼠均在结束尿动力学检查后，通过水合氯醛实施腹腔麻醉，中心点选定为L2～L3 椎间隙，取其上、下分别1 cm 左右位置的脊髓组织，通过生理盐水将取下的脊髓组织清洗干净，置于-80℃温度下保存待用。

尿动力学评价：所有大鼠完成麻醉处理后，将膀胱排空，将F3 导管置入尿道，连接微量灌注泵、多通道生理记录仪，保持0.1 ml/min 的恒定速度灌注恒温生理盐水，将各组大鼠膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、膀胱顺应性记录下来。

PCR 试验：根据基因库（GenBank）中大鼠热休克蛋白20（heat shock proteins-20，HSP-20）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）、BCL2-Associated X 蛋白质（BCL2-Associated X protein，Bax）、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、叉头框蛋白O1 （forkhead box protein O1，FOXO1）、β-actin 的mRNA 序列，通过Primer-BLAST 完成PCR 引物的设计。依据试剂说明书通过TRIzol 试剂相应提取三组大鼠脊髓组织的总RNA，通过反转录试剂盒反转录将RNA 为互补cDNA，继续依据说明书通过SYBR Green Ⅰ染料法完成定量PCR 试验。PCR 反应程序：95℃下进行0.5 min 预变性；94℃变性5 s，60℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min（上述3 个温度扩增40个循环）；最后72℃下进行10 min 延伸。实验共进行3次，以3 次平均值记录为最终结果。

Western blot 试验：称量50 mg 脊髓组织样品，匀浆处理，留心处理后留取上层清液，根据BCA 法说明书测定蛋白浓度，5×Loading buffer 混合均匀，行持续5 min 的沸水浴。每泳道上样蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶、湿法转膜，接着浸泡在5%脱脂奶粉中，室温环境下静置1 h 左右。之后把膜、一抗放在4℃冰箱中进行过夜孵育，1×TBST 进行3 次清洗，每次清洗持续10 min。接着选择1×TBST 稀释的二抗放在37℃环境下进行1 h 孵育，继续用1×TBST 进行3次清洗，每次清洗持续15 min。显色曝光后扫描底片，对蛋白灰度进行统计分析。

1.5 统计学方法

利用SPSS 23.0 分析所有数据，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，三组比较采用ANOVA 分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组尿动力学的比较

三组的膀胱顺应性、漏尿点压力、膀胱基础压、膀胱最大容量结果比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、电针组的上述指标均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组上述指标结果均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 三组大鼠尿动力学的比较（

±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；1 cmH2O=0.098 kPa

2.2 三组大鼠HSP20、PTEN 的mRNA 表达的比较

三组HSP20、PTEN 的mRNA 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、电针组大鼠脊髓组织HSP20 的mRNA 水平均低于对照组，PTEN 的mRNA水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组大鼠脊髓组织HSP20 的mRNA 水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组大鼠脊髓组织PTEN 的mRNA 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 三组大鼠脊髓组织HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比较（

±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

2.3 三组大鼠Akt 活化及凋亡通路mRNA 表达的比较

三组Bax、FOXO1、Bcl-2、Caspase-9、Akt 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、电针组Bcl-2、Akt 水平均低于对照组，Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型组，Bcl-2 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组、模型组Akt 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 三组大鼠脊髓组织Akt 通路凋亡相关因子mRNA 水平（

±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3 讨论

中医将尿潴留纳入“癃闭”范畴，认为其发生是由于肾气不足，膀胱气化失司，三焦无法通调水道而起[6]。本研究电针组治疗选择的穴位为次髎、中极以及三阴交穴，其中次髎为膀胱经穴位，不仅为局部取穴，也是膀胱病变治疗的常用穴位。中医典籍中有“次髎，主大小便不利”；三阴交穴是足三阴经交会穴，足三阴经循行少腹或阴器，有通调下焦气机的作用，可对膀胱功能起到调节作用[7]。中极穴是膀胱募穴，属于足三阴与任脉之会，中医中六腑病变取穴治疗多取此处穴位，中极穴被认为是膀胱病变治疗的重要穴位[8]。

从排尿反射神经通路这一层面来看，排尿中枢处在骶丛神经，次髎穴下有支配盆腔脏器的骶神经，对这一穴位进行针刺治疗能将与排尿相关的传入与传出神经激活，还能经传入神经元向高级中枢传导刺激，激发逼尿肌、膀胱内括约肌节律性收舒运动，最终建立并完成排尿反射[9]。三阴交穴位下通过着L4~S3 神经根的胫神经，且深层有L5、S1 神经节段，浅层有属于L4 神经节段的隐神经，通过对这一穴位进行刺激治疗能经反射弧传至脊髓后根，对腰骶部排尿中枢有激发作用，可促进反射性排尿[10]。研究对三阴交、次髎等穴位进行针刺治疗，显示患者尿道括约肌舒缩功能、膀胱运动功能均有明显改善，同时膀胱最大容量明显下降，残余尿量明显减少[11-12]。中极穴处在膀胱局部，是支配膀胱、直肠的神经分支-髂腹下神经，对这一穴位进行针刺治疗能对膀胱产生刺激，促使膀胱逼尿肌收缩，帮助膀胱皱襞能再次皱缩，促进排尿反射，生成尿意[13]。研究对关元与中极穴进行电针治疗，显示电针可经自主神经刺激传入神经，对膀胱活动形成调节，并能帮助恢复膀胱功能[14-15]。

本研究电针组治疗后膀胱最大容量、漏尿点压力、膀胱顺应性均较模型组明显下降，接近对照组水平，提示电针治疗能改善脊髓损伤尿潴留患者的排尿中枢功能，促使膀胱逼尿肌弹性提升，能帮助逼尿肌反射逐渐恢复，并维持正常收缩功能，减低膀胱最大容量，减少残余尿量，进而使膀胱功能得到改善。本研究电针组大鼠脊髓组织HSP20 的mRNA 水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组大鼠脊髓组织PTEN 的mRNA 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），证实HSP20 上升、PTEN 下降能提高Akt 活性，表明电针治疗对脊髓损伤尿潴留的作用机制可能与HSP20、PTEN 水平具有紧密联系。另外本研究显示模型组、电针组Bcl-2、Akt 水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组、电针组Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型组，Bcl-2 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组、模型组Akt 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示接受电针治疗能提升Akt 活性，并会对下游Bcl-2、Bax、Caspase-9、FOXO1 的表达产生影响，对细胞凋亡发挥抑制作用。上述结果表明，骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留会加快细胞凋亡，神经细胞受损，因此脊髓、膀胱功能会受到影响，膀胱排尿功能变得异常，最终引发尿潴留[16]。通过实施电针治疗，能加快HSP20表达，促进其磷酸化转变，对PTEN 表达产生抑制，并提升Akt 活性，提升下游Bcl-2 水平，对凋亡因子包括Bax、Caspase-9、FOXO1 的表达产生抑制，形成对细胞凋亡的抑制作用，最终帮助恢复部分脊髓神经功能，并使神经中枢对膀胱组织的调控得以提升，使逼尿肌、括约肌的功能以及膀胱内压维持在正常水平，使膀胱排尿功能、收缩功能得以改善，最终能使尿潴留症状逐渐减轻[17-18]。

综上所述，电针治疗骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留大鼠能改善其尿动力学，具体作用机制考虑与抑制PTEN 表达、促进HSP20 磷酸化与表达，并进一步抑制凋亡通路、提高Akt 活性相关。

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