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复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指发生两次或两次以上的自然流产，影响2%～5%的孕龄女性[1]，病因十分复杂，使用目前技术无法查出的致病因素，称为原因不明复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA），其80%以上主要与妊娠免疫耐受有关。据报道，维生素D（vitamin D，VD）在炎症反应、着床、免疫功能和胎盘血管生成中具有潜在作用，维生素D 缺乏（vitamin D deficiency，VDD）对胎盘发育和胚胎植入有不利影响[2-4]。尽管有这些发现，但人们对URSA、VD、VDD 这些因素之间联系的临床重要性的理解是有限的。近年来，研究VD与URSA 免疫相关的单个研究样本量少，且各研究间存在不一致，将目前的知识水平转化为临床建议具有挑战性。因此，本研究拟采用meta 分析的方法，对VD与URSA 免疫的相关性进行综合评价，以期为临床决策提供循证依据。

1 资料与方法

1.1 纳入标准与排除标准

1.1.1 研究类型随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）、病例对照研究。

1.1.2 研究对象病例对照研究中URSA 患者作为试验组，正常妊娠女性作为对照组。RCT 研究中，对URSA 患者进行分组，分为试验组和对照组。URSA 患者，均符合美国生殖医学学会最新指南的诊断标准[1]。

1.1.3 干预措施病例对照研究无干预措施。RCT 研究的干预措施为：试验组和对照组患者均给予常规治疗，如黄体酮、叶酸、阿司匹林、淋巴细胞免疫治疗，试验组在对照组干预措施的基础上加用VD。

1.1.4 结局指标 25-羟维生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]、自身抗体、淋巴细胞计数、流产率。

1.1.5 排除标准 ①个案、综述、基础研究、会议论文；②不同数据库重复检索出的文献；③数据不全且联系通讯作者也无法获取所需数据的文献。

1.2 文献检索策略

检索PubMed、EBSCO、CNKI、CBM、VIP 和万方医学网数据库，检索时间从建库至2021年1月，采用自由词与主题词相结合的方式进行检索。中文检索词包括：复发性流产、复发性妊娠丢失、维生素D、钙化醇、骨化三醇；英文检索词包括：recurrent miscarriage、recurrent spontaneous abortion、recurrent pregnancy loss、vitamin D、calciferol、25（OH）D。

1.3 文献筛选与资料提取

由2 位研究者独立筛选文献、提取资料并交叉核对，如遇分歧讨论解决或交由第三位研究者协助判定。采用自制的表格提取资料，包括：纳入研究的基本信息；研究对象的基本特征；VD 定量方法：化学发光法（chemiluminescent immunoassay，CL）、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、液相色谱/串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrum，LC-MS/MS）；结局指标等。

1.4 文献质量评价

RCT 和病例对照研究分别采用改良版Jadad 量表[5]和纽卡斯尔-渥太华量表（Newcastle-Ottawa scale，NOS）[6]进行质量评价。

1.5 统计学方法

采用RevMan 5.3 版统计软件进行meta 分析。计量资料以标准化均数差（standardized mean difference，SMD）及其95%置信区间（confidence interval，CI）表示，计数资料：RCT 以相对危险度（relative risk，RR）及其95%CI 表示；病例对照研究以比值比（odds ratio，OR）及其95%CI 表示。若各研究间统计学异质性较小（I2＜50%且P＞0.1），采用固定效应模型；反之，则采取随机效应模型。采用敏感性分析找出对异质性影响较大的文献，并分析具体原因。meta 分析的检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 文献检索结果

初检共获得相关文献405 篇，经逐层筛选后，最终纳入12 篇文献[7-18]，其中英文文献6 篇[7-8，14，16-18]，中文文献6 篇[9-13，15]，共2114 例受试者，文献筛选流程及结果见图1。

图1 文献筛选流程图

2.2 纳入研究的基本特征和质量评价结果

纳入研究的基本特征见表1，病例对照研究和RCT 的质量评价分别见表1 和表2。

表1 纳入研究基本信息和质量评价

文献[7-15]是病例对照研究，所以无干预措施，需要进行NOS 评分。（1）对照组干预措施：①黄体酮阴道给药400 mg/d；②叶酸口服5 mg/d；③阿司匹林口服81 mg/d；④淋巴细胞免疫治疗，1 ml，静脉滴注。（2）试验组干预措施：⑤对照组干预措施+VD 0.5 mg/d 口服；⑥对照组干预措施+VD 3 万IU/d肌内注射；⑦对照组干预措施+VD 400 IU/d 口服。（3）结局指标：Ⅰ表示25（OH）D；Ⅱ表示自身抗体；Ⅲ表示淋巴细胞计数；Ⅳ表示流产率

表2 3 篇RCT 文献的质量评价

2.3 meta 分析结果

2.3.1 25（OH）D 水平共纳入7 篇文献[7-13]，URSA 作为试验组，正常妊娠女性作为对照组，检测两组的血清25（OH）D 浓度。各研究间有统计学异质性（P＜0.000 01，I2=95%），采用随机效应模型。meta 分析结果显示，试验组的25（OH）D 水平低于对照组，差异有统计学意义[SMD=-1.46，95%CI（-2.08，-0.84），P＜0.000 01]（图2）。

图2 试验组与对照组患者25(OH)D 水平的meta 分析森林图

2.3.2 自身免疫抗体共纳入3 篇文献[11，14-15]，根据血清25（OH）D 浓度将URSA 患者分为试验组（＜30 ng/ml）和对照组（≥30 ng/ml），检测两组的抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）、抗核抗体（antinuclear antibodies，ANA）。各研究间无统计学异质性，采用固定效应模型。meta 分析结果显示，25（OH）D＜30 ng/ml 组URSA 患者的TPOAb、ACA、ANA 阳性率高于25（OH）D≥30 ng/ml 组，差异有统计学意义[OR=3.87，95%CI（2.27，6.60），P＜0.000 01；OR=2.96，95%CI（1.53，5.75），P=0.001；OR=2.54，95%CI（1.54，4.17），P=0.0002]（图3）。

图3 25（OH）D＜30 ng/ml 组与25（OH）D≥30 ng/ml 组URSA 患者TPOAb、ACA、ANA 的meta 分析森林图

2.3.3 淋巴细胞计数共纳入3 篇文献[11，14-15]，根据血清25（OH）D 浓度将URSA 患者分为试验组（＜30 ng/ml）和对照组（≥30 ng/ml），检测两组的CD4+T、CD56+NK、CD19+B 细胞计数。各研究间有统计学异质性，故采用随机效应模型。meta 分析结果显示，25（OH）D＜30 ng/ml组的CD4+T、CD56+NK 细胞计数高于25（OH）D≥30 ng/ml 组，差异有统计学意义[SMD=1.65，95%CI（1.29，2.01），P＜0.000 01；SMD=0.83，95%CI（0.35，1.31），P=0.0008]；而25（OH）D＜30 ng/ml 组与25（OH）D≥30 ng/ml组URSA 患者的CD19+B 细胞计数比较，差异无统计学意义[SMD=1.74，95%CI（-1.07，4.56），P=0.22]（图4）。

图4 25（OH）D＜30 ng/ml 组与25（OH）D≥30 ng/ml 组URSA 患者淋巴细胞计数的meta 分析森林图

2.3.4 流产率共纳入3 篇文献[16-18]，将URSA 患者随机分为试验组和对照组，试验组在VD 治疗一定时间后，对两组研究对象进行随访并记录妊娠结局。各研究间无统计学异质性（P=0.62，I2=0%），采用固定效应模型。meta 分析结果显示，试验组URSA 患者的流产率低于对照组URSA 患者，差异有统计学意义[RR=0.53，95%CI（0.31，0.89），P=0.02]（图5）。

图5 两组URSA 患者流产率的meta 分析森林图

2.3 敏感性分析

25（OH）D、CD56+NK、CD19+B 存在统计学异质性，改变研究效应模型，前后结果无明显变化。25（OH）D指标考察中，当剔除“王立芹[9]”“郝月兰[11]”“黄仲英[13]”的研究后，异质性检验P=0.17，I2=40%，剔除后合并效应值无明显变化，说明这几项研究虽然是该指标异质性的主要来源，但并未对研究结果产生影响，本研究敏感性低，结果较为稳健可靠。CD56+NK、CD19+B 研究存在异质性较高且无法判断异质性来源的缺陷，故结果可信度较低。

3 讨论

本研究结果显示，试验组的25（OH）D 水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示VDD 的育龄女性更易发生RSA。Andersen 等[19]的一项前瞻性队列研究表明，VDD 与妊娠早期流产风险增加相关。齐雅杰[20]的研究结果也充分说明，RSA 与VDD 有关，表明RSA 患者补充VD 是有意义的。

本研究结果显示，25（OH）D＜30 ng/ml 组URSA患者的TPOAb、ACA、ANA 阳性率高于25（OH）D≥30 ng/ml组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示这些抗体与自身免疫性疾病和生殖结局不良有关，而自身免疫异常是生殖失败的一个风险因素。VDD 和自身免疫性疾病的易感性和严重性是密切相关的，VD 通过抑制活化的B 细胞持续增殖及诱导B 细胞凋亡，调节自身抗体产生，而VDD 可诱导B 细胞过度活化，导致自身抗体水平增加[21]，进而影响妊娠过程。

本研究结果还显示，25（OH）D＜30 ng/ml 组的CD56+NK 细胞计数高于25（OH）D≥30 ng/ml 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。据报道，妊娠前期对RSA 患者NK细胞活性的评估可以预测下一次的妊娠结局[22]。此外，孕妇外周血NK 细胞水平升高可预测正常核型孕妇的自然流产[23]。Chen 等[24]研究结果表明，VD 能够去极化细胞质中穿孔素的表达，从而降低RSA 患者的NK细胞毒性，提示VD 可能在调节RSA 患者NK 细胞的数量和活性中起重要作用。此外，本研究结果还显示，25（OH）D＜30 ng/ml 组的CD4+T、CD56+NK 细胞计数高于25（OH）D≥30 ng/ml 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。VD 已被证明可调控活化T 细胞，抑制胎盘中促炎Th1 细胞因子如γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的产生，诱导Th2 细胞因子如白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-10 的产生[25]。

补充VD 能改善RSA 患者的妊娠结局，从生殖免疫学的角度，妊娠属于同种异体移植的过程，依赖于母体对胎儿的正确识别和免疫耐受，而RSA 的发生则是同种异体移植失败的表现[26]，VD 可能通过降低自身抗体、Thl/Th2 型的Th2 型细胞因子偏移，及调控NK 细胞数量和功能等途径促进母体对胚胎产生免疫耐受，避免母体对胚胎发生免疫排斥反应，从而促进成功妊娠[27]。

研究的局限性：①本研究纳入的结果可能受到定量方法多样性的影响，导致这些研究具有不同程度的偏倚。②纳入的病例对照设计，可能高估了这种关联的影响大小，并使暴露与结果之间的时间关系变得不太清楚。③每种结果可用的研究数量较少可能存在发表偏倚。

综上所述，VDD 的RSA 患者自身抗体阳性率、CD4+T 和NK 细胞均升高，这些都是URSA 的危险因素。补充VD 可降低流产率，表明VDD 可能是URSA涉及的免疫学改变的病因或恶化因素，因此推测VD可能是这一特定妇女群体的治疗选择。但由于本研究数据的观察性质和研究数量较少，无法从这些发现中推断出因果关系，因此仍需要高质量RCT 来研究证实VD 和URSA 患者免疫因素之间的关系。

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