肺结核是一种由结核杆菌感染肺部导致的传染性疾病，早期症状轻微，随着疾病发展，肺结核患者逐渐出现畏寒、出汗、间歇性咳嗽等症状，随着疾病发展，患者甚至出现咯血现象，严重影响患者身体健康[1]。近年来，随着人们健康意识提升，每年进行健康体检的人群增多，大批无症状结核患者被及早发现，为患者早期治疗、控制结核病蔓延奠定了基础。据全国第五次结核病流行病学抽样调查中，在参与调查的10万人中，活动性肺结核为459 例，占0.46%，其中，涂阴肺结核的患病率占总患病数的85.62%[2]。在诊断结核病时，疾病确诊离不开细菌学，增大了涂阴肺结核快速诊断难度。现有诊断技术中，涂片镜检迅速且便利，但敏感性不足。且结核菌培养时间超过2 周。结核分枝杆菌RNA 恒温扩增实时荧光检测技术（simultaneous amplification and testing for Mycobacterium tuberculosis，SAT-TB）检测迅速，仅需要1～2 h，但容易因外力因素（如污染等）出现假阳性，灵敏度低，对实验员的专业性要求高。因结核的特异性，效应T 细胞会向病变位置集中，依照该特点，本研究收集患者肺泡灌洗液，进行结核感染效应T 细胞斑点试验（T-cell spot test，T-SPOT），通过计算肺泡灌洗液内结核杆菌特异性单核细胞，快速诊断肺结核。

选取2019年1月至12月江西省胸科医院收治的80 例疑似肺结核患者作为研究对象，按照痰涂片检验结果将其分为涂阳组（35 例）与涂阴组（45 例）。涂阳组中，男24 例，女11 例；年龄25～67岁，平均（46.02±4.02）岁；病程2～6 个月，平均（4.42±0.41）个月；肺结核17 例，结核性腹膜炎13 例，其他5 例。涂阴组中，男28 例，女17 例；年龄26～67 岁，平均（46.53±4.47）岁；病程2～6 个月，平均（4.32±0.43）个月；肺结核18 例，结核性腹膜炎12 例，其他5 例。两组患者的年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。纳入标准：①患者既往无结核病史；②患者血清HIV 检测为阴性；③遵循 《肺结核诊断和治疗指南》[3]，对患者肺泡灌洗液均进行SAT-TB、T-SPOT 检测；④患者愿意参与本研且所有患者及其家属均知情同意。排除标准：①精神障碍患者；②合并严重肝、肾、心脏疾病患者；③患者一般资料不全。

标本采集：使用日本1575k 型电子支气管镜对患者进行检查，于患者肺部CT 影像学检查病灶位置的支气管肺段，将灌洗液（0.9%氯化钠溶液；江西科伦药业有限公司；生产批号：20200912）注入支气管肺泡灌洗，以YX930D 型负压吸引器（上海宝佳医疗器械有限公司）回收灌洗液30 ml，送检验科进行T-SPOT、SAT-TB 检测。

T-SPOT 检测：收集肝素抗凝肺泡灌洗液10 ml，以双层纱布过滤，去除灌洗液内杂质，在离心机内以离心半径5 cm、离心速度1200 r/min 离心10 min，去除上层清液，留下层浓液，分离其中单核细胞，调节细胞数达2.5×105/ml，选择T-SPOT 试剂盒，根据说明书进行操作，步骤如下：将单核细胞分离，和培养滤过蛋白CFP-10、结核特异性抗原分泌靶向抗原ESAT-6放于抗γ-干扰素抗体预包被板内孵育，恒温37℃，孵育16～20 h。使用ELR06IFL 型自动读板仪（德国艾迪公司）对斑点计数，无反应对照0～5 孔点，有反应标本为：抗原A/B 点数-无反应对照孔6 点为阳性；若无反应对照孔点≥6，有反应标本为：抗原A/B 点数≥无反应对照孔的2 倍为阳性。

SAT-TB 检验：在肺泡灌洗液内添加4%氢氧化钠溶液，使灌洗液内黏液液化，采用检测试剂盒检测，并依照说明书操作。注意：液化体积不高于标本量1 倍。

①观察涂阴组与涂阳组患者肺泡灌洗液T-SPOT检测阳性率，阳性率=阳性例数/总例数。②以分子生物学检查结果为金标准，观察T-SPOT 与SAT-TB 在涂阴肺结核检测中的准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值（positive predictive value，PPV）与阴性预测值（negative predictive value，NPV）。准确率=（真阳性+真阴性）例数/总例数×100%，灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%，PPV=真阳性/（真阳性+假阳性）×100%，NPV=真阴性/（真阴性+假阴性）×100%。

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

涂阳组患者的阳性率为97.14%（34/35），高于涂阴组的75.56%（34/45），差异有统计学意义（χ2=7.196，P=0.007）。

T-SPOT 检测的准确率为93.33%（42/45），高于SAT-TB 检测的80.00%（36/45），差异有统计学意义（χ2=7.688，P=0.006）（表1）。

T-SPOT 检测的灵敏度、NPV 高于SAT-TB 检测，差异有统计学意义（P＜0.05）。两种检测方式的特异度、PPV 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

目前结核病仍是全球主要传染病之一，致死率高，危害性大，若能够及早发现结核病并治疗，对控制结核病具有重要意义[4-6]。结核杆菌的确诊，离不开细菌学、病理学，细菌学应用较为广泛，但是，部分细菌检测为阴性者也可能感染肺结核，易发生诊断疏漏，不利于结核病筛查与控制，而病理学检测虽然准确，但耗时长，不利于普及。随着微创技术的完善和腔镜器械的广泛应用，已有诸多研究[7-9]证实肺泡灌洗液相关检测可显著提升结核病诊断阳性率。

T-SPOT 作为酶联免疫斑点检测技术，以结核患者特异性T 细胞的免疫应答作为基础，检验抗原释放的γ-干扰素，当受检人体内受到结核杆菌的抗原刺激，T 淋巴细胞致敏，并再次与同类抗原相遇，将释放γ-干扰素[10-12]。通过检测单细胞内分泌γ-干扰素的数目，判断受检人是否感染结核杆菌。并且，活动性肺结核患者的特异性T 细胞扩大与克隆会浓缩于患者病灶部位，因此，以T-SPOT 检测受检人的肺泡灌洗液，能够准确区分受检人为活动性结核或者潜伏性结核[13]。本研究结果显示，T-SPOT 检测下，涂阳组的阳性率（97.14%）高于涂阴组（75.56%），差异有统计学意义（P＜0.05）。对涂阴组检测时，T-SPOT 检测涂阴肺结核的阳性率（94.29%）高于SAT-TB 检测（77.14%），差异有统计学意义（P＜0.05）；T-SPOT 检测的灵敏度、NPV 高于SAT-TB 检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；两种检测方式的特异度、PPV 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示T-SPOT 检测效果更加准确，值得推广。在王琳等[14]的研究中，T-SPOT 检查的灵敏度较高，为91.1%，与本研究结果一致。T-SPOT 检测用时短，特异度高，可能和涂阴肺结核的结核杆菌数量较少相关，即使利用灌洗液在病灶处收集结核杆菌，结核杆菌的数量依然有限，而T-SPOT 检测技术主要检测单个核细胞内抗原致敏T 细胞的数量，并非检测细菌数量，因此，与其他检测方式比较，T-SPOT 检测的特异性高，敏感性强，诊断价值高[15-18]。

综上所述，肺泡灌洗液效应T 细胞检测在涂阴肺结核中的灵敏度高，且检测速度快，在肺结核筛查中具有重要意义，值得推广。

[1]黄明翔，陈新朝，陈晓红，等.KODDNA 聚合酶荧光PCR技术在肺结核诊断中的应用评价[J].中国人兽共患病学报，2020，36（10）：852-857.

[2]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508.

[3]中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志，2001，24（2）：70-74.

[4]蔡和伦，李平，董燕，等.经皮肺穿刺活检组织XpertMTB/RIF 对肺结核的诊断价值[J].昆明医科大学学报，2020，41（8）：94-99.

[5]熊梦园，方芳，李一荣.XpertMTB/RIF 检测技术对肺结核的诊断价值[J].海南医学，2020，31（5）：554-558.

[6]陈丹霞，曹东林，林茂锐，等.3 种检测方法对不同年龄组肺结核疑似患者诊断价值的对比分析[J].国际检验医学杂志，2020，41（22）：2792-2796，2813.

[7]苏萌.不同检测方法对痰液标本中结核杆菌检测结果的影响[J].甘肃科技，2018，34（6）：79-80.

[8]袁瑛，明湘虹，郑宏，等.SAT 技术与荧光定量PCR 在痰涂片阴性肺结核诊断中的价值研究[J].临床肺科杂志，2019，24（3）：538-540.

[9]唐婧，王庆，徐东芳，等.肺泡灌洗液不同检测方法在肺结核诊断中的临床价值[J].临床肺科杂志，2019，24（1）：133-134，182.

[10]鲍方进，马冬春，刘洁，等.安徽省县级涂阴肺结核患者诊断质量抽样调查结果及影响因素分析[J].中国防痨杂志，2020，42（11）：1221-1226.

[11]张丽媛，刘昌江，杜永国，等.结核感染T 细胞斑点试验及结核抗体检测在肺结核诊断中应用[J].中国热带医学，2019，19（1）：100-102.

[12]王明远，赵顺现.濮阳市涂阴肺结核患者采用利福平耐药实时荧光定量核酸扩增联合T-SPOT.TB 检测的应用效果[J].实验与检验医学，2020，38（1）：166-168.

[13]李苏梅，包紫薇，唐佩军，等.荧光定量PCR 对痰涂片阴性肺结核的临床诊断价值[J].临床肺科杂志，2018，23（6）：977-979.

[14]王琳，施军卫，陈俊林，等.肺泡灌洗液效应T 细胞检测对涂阴肺结核的快速诊断价值[J].临床肺科杂志，2019，24（4）：588-591.

[15]沈雷雷，范晓云，包训迪.涂阴肺结核的临床特征及结核杆菌利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术对其诊断价值[J].安徽医科大学学报，2020，55（9）：1475-1478.

[16]王明远，赵顺现.濮阳市涂阴肺结核患者采用利福平耐药实时荧光定量核酸扩增联合T-SPOT.TB 检测的应用效果[J].实验与检验医学，2020，38（1）：166-168.

[17]王甲洪，马永芬，潘艳，等.结核分枝杆菌效应T 细胞计数对肺结核的诊断价值[J].中国国境卫生检疫杂志，2020，43（3）：201-203.

[18]蔡向敬，王桂英，段月庭.XpertMTB/RIF 联合T 细胞斑点试验用于检测涂阴肺结核的价值研究[J].临床肺科杂志，2018，23（5）：956-958，966.

Diagnostic value comparison of effector T cell spot test of alveolar lavage fluid and RNA constant temperature amplification real-time fluorescence detection for smear-negative pulmonary tuberculosis

HUANG Jian ZHANG Zhi-da▲ LI Xi-jiu
Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Jiangxi Chest Hospital,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China

[Abstract]Objective To compare the diagnostic value of effector T cell spot test(T-SPOT)of alveolar lavage fluid and RNA constant temperature amplification real-time fluorescence detection(STA-TB)for smear-negative pulmonary tuberculosis.Methods Eighty patients with suspected tuberculosis who were admitted to Jiangxi Chest Hospital from January to December 2019 were selected.Sputum smears showed that there were 35 cases in the smear-positive group,and 45 cases in the smear-negative group.The molecular biological examination of 45 cases in the smear-negative group showed that 35 cases were diagnosed as pulmonary tuberculosis,and 10 cases were diagnosed as non-tuberculosis infection.The effector T cells in the alveolar lavage fluid of the smear-positive and smear-negative group patients were detected by the tuberculosis infection effect T-SPOT,and the positive rate were analyzed.The alveolar lavage fluid were collected from the patients in the smear-negative group and alveolar lavage fluid were detected by using mycobacterium tuberculosis simultaneous amplification and testing for SAT-TB.The diagnostic value of the effect of alveolar lavage fluid T cell detection were analyzed by comparing results with T-SPOT detection.Results By the T-SPOT test,the positive rate of smear-positive group(97.14%)was higher than that in smear-negative group(75.56%),and the difference was statistically significant(P＜0.05).When the smear-negative group was tested,the positive rate(94.29%)in the smear-negative tuberculosis group by T-SPOT was higher than that in SAT-TB test(77.14%),and the difference was statistically significant(P＜0.05).By T-SPOT test,the sensitivity(94.29%),the positive predictive value(PPV)(97.06%)and the negative predictive value(NPV)(81.82%)were higher than those in SAT-TB(77.14%,96.43%,and 52.94%),and the differences were statistically significant(P＜0.05).The specificity of the two detection methods were both 90.00%.Conclusion In the rapid detection of smear-negative pulmonary tuberculosis,the detection of effector T cells in alveolar lavage fluid has high sensitivity and remarkable application value.

[Key words]Alveolar lavage fluid;Effector T cells;Smear-negative pulmonary tuberculosis;Diagnosis

[基金项目]江西省卫生厅科技计划项目（20165512）。

（收稿日期：2021-03-10）