葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（glucose-6-phos phate dehydrogenase deficiency，G6PDd），又称为“蚕豆病”，是我国广东、广西、海南等沿海省份高发的病种之一[1]。G6PDd 患儿在服用蚕豆后就会出现核黄疸及急性溶血症状，严重威胁患儿性命。G6PDd 目前没有有效的根治措施，以预防及对症治疗为主。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）建议，在男性G6PDd 发病率超过3%～5%的高风险地区应常规开展新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氧酶（glucose-6-phosphate，G6PD）的筛查[2]。通过对患儿进行最有效的早筛查、早诊断、早干预，从而避免溶血、核黄疸等不良后果的发生[3]。荧光定量法是G6PD 筛查的常用方法，但目前G6PD 的筛查切值目前尚没有统一标准。章晓燕等[4]在2015年调查我国220 家筛查实验室，结果显示G6PD 切值分布在2.00～10.00 U/g Hb，且不同实验室来源的样本，其诊断的切值也存在一定的差别。本研究对江门市新生儿遗传代谢病筛查中心的G6PD 筛查情况、召回情况进行回顾性分析，旨在了解江门市新生儿的G6PD 突变基因型，并通过回顾分析制定适合的切值，以期提高阳性预测值。

收集2018年1月至2020年5月在江门市新生儿遗传代谢病筛查中心进行G6PD 筛查的113 665 例新生儿血斑者作为研究对象进行回顾性分析，其中男59 651 例，女54 014 例，男女比例为1.1∶1。所有参与筛查的新生儿家属或监护人均签署知情同意书，并自愿参与本研究。本研究已经相关医学伦理委员会批准。

纳入标准：①出生满72 h 者；②充分哺乳8 次以上者。排除标准：①哺乳不足者；②临床资料不全，无法召回者。

1.2.1 G6PD 荧光定量法 在新生儿监护人知情同意下，新生儿在生后48 h 并充分哺乳8 次以上后，由专科护士采集足跟血制成干血斑。血斑通过快递送至江门市新生儿遗传代谢病筛查中心检测。使用广州丰华生物工程有限公司G6PD 荧光定量分析试剂盒进行检测，实验过程严格按试剂说明书操作。对G6PD≤3.0 U/g Hb 判定为阳性，并均对该范围内的新生儿进行召回，召回成功的疑似G6PDd 新生儿有889 例。同时随机选取初筛G6PD 阴性的2839 例新生儿进行追踪随访，采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析G6PD 荧光定量法筛查的切值。

1.2.2 G6PD 酶活性检测 将889 例召回的可疑G6PDd新生儿进行进一步分析。采集召回的可疑G6PDd 患儿静脉血，采用G6PD 定量测定试剂盒速率法（北京利德曼生物有限公司）及TBA-2000FR 全自动生化分析仪（日本东芝）测定酶活性，以酶活性＜1300 U/L 者诊断为阳性。

1.2.3 G6PD 热点基因变异检测 采用多色熔解曲线G6PD 基因突变检测试剂盒（厦门致善生物科技公司）及SLAN96P 荧光定量PCR 仪（上海宏石医疗科技有限公司），对国内常见的12 种突变位点（c.95A＞G、c.383T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A）进行定性测定，严格按照试剂说明书进行操作。

统计113 665 例新生儿的G6PD 荧光定量法筛查结果，并进一步统计889 例召回的可疑G6PDd 新生儿的热点基因变异检测及酶活性确诊结果，分析G6PD 荧光定量法的切值。其中G6PD 荧光定量法筛查阳性和召回的标准均为G6PD≤3.0 U/g Hb。酶活性检测阳性的标准为＜1300 U/L，正常范围为≥1300 U/L。

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计数资料采用率表示。G6PD 荧光定量法诊断切值用ROC 进行分析确定，根据ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）的最大确定最终的切值。

对113 665 例新生儿G6PD 荧光定量法筛查结果进行分析，以≤3.0 U/g Hb 为切值，对所有G6PD 荧光定量法筛查结果进行统计学分析，各项指标结果见表1。结果显示，共筛查出可疑阳性男婴4180 例，女婴814 例，男女比例为5.14∶1。男女初筛阳性率分别为7.01%、1.51%，总体筛查阳性率达4.39%。

男、女婴的G6PD 荧光定量法筛查分布结果见图1、2，结果显示，男婴筛查结果呈双峰分布，女婴筛查结果大致呈正态分布，分别在2.9～3.2 U/g Hb 及1.8～2.0 U/g Hb 存在波谷。

召回的889 例疑似G6PDd 新生儿中，有222 例进行了热点基因突变检测，共检测出220 例发生突变。男婴188 例半合子突变，突变类型以c.1388G>A（占比33.51%）、c.1376G>T（占比30.32%）、c.95A>G（占比14.36%）、c.871G>A（占比9.57%）、c.1024C>T（占比6.91%）的检测率较高，占男婴突变位点的94.68%（表2）；女婴杂合突变20 例，复合杂合10 例，纯合1例，双重杂合1 例（表3）。

召回的889 例疑似G6PDd 新生儿中，有835 例进行酶活性确诊，男婴724 例，确诊阳性715 例，女婴111 例，确诊阳性86 例。召回的889 例疑似G6PDd 新生儿中，同时进行热点基因突变检测及酶活性确诊的有179 例，其中有7 例酶活性在正常范围内，均为女性，即有7 例女婴的酶活性结果与G6PD 荧光定量法筛查方法结果不一致。后经热点基因突变检测，均确诊为杂合突变。

针对召回的889 例疑似G6PDd 新生儿以及随机选取初筛G6PD 阴性的2839 例新生儿进行追踪随访，采用ROC 分析G6PD 荧光定量法筛查的切值。随访共得到假阳性43 例，假阴性12 例。

按性别的不同对G6PD 荧光定量法进行ROC 曲线分析，AUC 最大值作为该筛查方法的最佳切值，结果见图2。结果显示，男、女婴的AUC 最大值分别是0.992 和0.888，其所对应的男婴和女婴G6PD 水平的切值分别为2.98、2.97 U/g Hb（表4）。

G6PD 基因突变时，机体红细胞膜上的G6PD 酶数量减少或活性降低，导致还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成减少，不能维持红细胞的柔韧性，红细胞不易通过脾窦或肝窦而被破坏，容易导致新生儿高胆红素血症甚至核黄疸[5-6]。有研究报道[7]显示，16.4%的G6PDd 患儿因高胆红素血症需要输血治疗，几乎是非G6PDd 新生儿的5 倍。G6PDd 目前没有根治的治疗手段，及早确诊、健康教育、预防发病是目前最重要的预防措施。G6PD 缺乏症在我国的发病率呈南高北低的趋势，广东省是G6PDd 的高发区，发病率可达3.1%～16.1%[8-9]。因此，将G6PDd 列入新生儿疾病筛查，有助于预防G6PDd 导致的新生儿高胆红素脑病及严重溶血性贫血，因此早期确诊、健康教育，对避免新生儿触及致病因素等显得尤为重要。

江门市筛查中心自2005年起，开始推广G6PDd筛查，2018年将G6PDd 筛查纳入新生儿遗传代谢病筛查补助项目，对江门市新生儿进行普筛。本研究选取2018年1月至2020年5月在江门市新生儿遗传代谢病筛查中心进行筛查的113 665 例新生儿血斑者作为研究对象进行回顾性分析，以确诊方法评估目前的筛查手段，制定合适的切值，以提高阳性预测值。江门市的男、女婴初筛阳性率分别为7.01%、1.51%，总体筛查阳性率达4.39%，整体处于中等水平，这与相关报道[10]的结果大致相符。

目前G6PDd 的诊断性方法主要有G6PD 酶活性检测和基因突变检测。在本研究中热点基因检测结果显示，男婴188 例半合子突变，突变类型以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.392G>T 较为多见，其中以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G三者的检出率较高，而前两者也是中国人特有的与G6PD 活性相关的基因突变位点，验证了既往相关研究者们[11-12]的研究结论。酶活性检测方法简单、快速且成本低，容易在各医疗单位开展。本研究中筛查阳性与酶活性检测，男婴、女婴符合率分别为98.76%、77.48%。根据随机失活学说，女性杂合子由于其X 染色体随机失活，导致部分女性杂合子酶活性可在正常范围内，故呈现出X 连锁半显性遗传[13]。因此单以酶活性作为诊断标准时，男婴的符合率高，女婴的符合率偏低[14]。对女性杂合子、临床高度怀疑而酶活性正常者，基因检测是确诊的重要依据，本研究中，有7 例女婴的酶活性结果与G6PD 荧光定量法筛查方法结果不一致，后经热点基因突变检测，均确诊为杂合突变，因此对于女性杂合突变者，单以酶活性作为确诊依据，有可能会造成漏诊，建议有条件的单位应开展G6PD 基因检测更佳。

各地筛查中心的切值来源主要是试剂盒说明书、筛查共识，但由于各地的发病率不同，因此筛查中心需不断积累各自实验室的数据，制定本地区、本实验室的切值，以降低假阳性，防止假阴性的发生[15]。如果单纯通过百分位数法来制定切值，难以确定百分位数的范围。ROC 曲线能把筛查方法切值的灵敏度和特异度平衡在一个最佳点，对追踪随访的3728 例新生儿进行ROC 曲线分析，男婴和女婴AUC 分别为0.992 和0.888，其所对应的男婴和女婴G6PD 水平的切值分别为2.98、2.97 U/g Hb，因此笔者建议，将G6PD 荧光定量法切值设为3.0 U/g Hb 是比较符合的。不过在张钰等[16]的研究中，四川新生儿G6PD 荧光定量法的筛查切值在3.4 U/g Hb，与本研究结果之间存在一定的差异。分析原因，可能是由于地区不同，也可能是由于本研究的样本量数据不够大，因此结果有所偏差。因此各地筛查中心在今后的工作中需要不断积累数据进行进一步的回顾性分析，以便得到更切合各地区实际的切值，从而尽可能地降低假阳性率。

综上所述，江门市新生儿G6PD 基因突变的发生情况处于中等水平，其中以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.392G>T、c.1360C>T、c.1004C>A 为主要突变位点。建议以3.0 U/g Hb 作为江门市G6PD 荧光定量法筛查的切值，是较为符合的，有助于减少假阳性率。

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Tangent analysis and the occurrence of genetic mutations of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency screening method for newborns in Jiangmen city

YANG Ying-song ZHONG Zhi-lai YANG Mei TAN Jie-liang LIU Ying-yan ZENG Qin-long LI Zhi-ming TANG Jia
Medical Genetics Center,Jiangmen Maternal and Child Health Hospital,Guangdong Province,Jiangmen 529000,China

[Abstract]Objective To investigate the genetic mutations of glucose 6-phosphate dehydrogenase(G6PD)in newborns in Jiangmen city,and to explore the cut-off value of G6PD fluorescence quantitative screening in Jiangmen city.Methods From January 2018 to May 2020,113 665 cases of newborns with blood spots who were screened in the Neonatal Genetic Metabolic Disease Screening Center in Jiangmen City were selected as the study subjects for retrospective analysis,and G6PD detection and screening were performed by fluorescence quantitative method.A total of 889 cases of recalled G6PD screening positive newborns were selected as suspected G6PD deficiency(G6PDd)newborns for investigation,and their venous blood was collected for G6PD enzyme activity or hot spot gene mutation detection.The results of G6PD fluorescence quantitative screening in all newborns were counted,and the results of hot spot gene mutation detection and G6PD enzyme activity diagnosis in newborns suspected of G6PDd were counted.At the same time,889 newborns suspected of G6PDd and 2839 newborns initially screened with G6PD negative were followed up,ROC curve was used to analyze the cut-off value of G6PD fluorescence quantitative method.Results In Jiangmen city,the positive rates of male and female were 7.01% and 1.51%,respectively,and the overall positive rate of screening was 4.39%.Of 889 newborns suspected of G6PDd,222 newborns were tested for hot spot gene mutation detection,and the mutations were detected in 220 cases.Hemizygous mutation in 188 male infants,the detection rates of c.1388G>A,c.1376G>T,c.95A>G,c.871G>A,c.1024C>T,c.392G>T,c.1360C>T,c.1004C>A were high,accounted for 94.68%of male mutation sites detected.Enzyme activity was confirmed in 835 cases,and there were 801 confirmed positive cases.ROC curve analysis of G6PD fluorescence quantitative screening values showed that the maximum AUC values of male and female were 0.992 and 0.888,respectively,and the corresponding G6PD cut-off values were 2.98 and 2.97 U/g Hb,respectively.Conclusion The occurrence of neonatal G6PD gene mutation in Jiangmen is at a moderate level,in which c.1388G＞A,c.1376G＞T,c.95A＞G,c.871G＞A,c.1024C＞T,c.392G＞T,c.1360C＞T,c.1004C＞A are the main mutation sites.It is suggested that 3.0 U/g Hb should be used as the cut-off value for the fluorescence quantitative screening of G6PD in Jiangmen city.

[Key words]Glucose-6-phosphate dehydrogenase;Neonatal disease screening;Gene mutation;Cut-off value

[基金项目]广东省江门市卫生计生局科研项目（18A069）。

（收稿日期：2020-09-16）