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尿酸是嘌呤的最终代谢产物，由于灵长类动物缺乏尿酸酶降解尿酸，人体尿酸产生的增加和排泄的减少均会导致血清尿酸增高，形成高尿酸血症（HUA）[1]。临床上HUA 诊断的标准为正常嘌呤饮食情况下，非同日2 次测定空腹血清尿酸水平，男性和绝经后女性＞420 μmol/L（7.0 mg/dL），绝经前女性＞350 μmol/L（5.8 mg/dL）即为HUA[2]。

随着人们生活水平不断提高，社会竞争力越来越强，无规律的作息、高脂肪高糖饮食、酗酒、熬夜、睡眠不足、精神压力大等不良生活习惯普遍存在，导致胃肠功能紊乱、内分泌失调，亚健康人群数目不断增多，HUA 的发病率也在逐年升高（10%以上）。20世纪90年代中期以后调查显示，男性HUA 患病率为8.2%～19.8%，女性为5.15%～7.65%[3]。21世纪初我国男性血尿酸水平达288～427 μmol/L，女性为223～317 μmol/L，HUA 患病率男性为7.3%～58.4%，女性为1.3%～23.8%[4]。现代医学研究表明，当体内的尿酸水平长期维持在较高水平，就会在关节和软组织中沉积并对脏器造成损伤，因此对于HUA 的研究越来越受重视[5]。故选择相对合适的HUA 动物模型对其机理及药效研究尤其重要，建立一个稳定合理的HUA 动物模型更是刻不容缓。

目前常用的HUA 模型的动物为啮齿类动物，但与人类不同的是其体内含有尿酸酶可将尿酸分解为尿囊素。氧嗪酸钾属于三氮杂苯类化合物，其化学结构与尿酸的嘌呤环相似，故可与尿酸酶结合[6]。所以在给啮齿类动物造模时常运用氧嗪酸钾抑制尿酸酶的活性，减少尿酸的分解从而引起HUA[7-8]。但由于氧嗪酸钾易被机体代谢，单一给药在短时间内尿酸水平差异较大，用其建立HUA 的急性模型仍然有非常多的不可控因素。因此，本研究采用氧嗪酸钾与尿酸、次黄嘌呤、乙胺丁醇联合用于制备急性小鼠HUA 模型，比较各时间点小鼠尿酸的变化，为制备更稳定的急性HUA 动物模型提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 实验动物

SPF 级ICR 小鼠320 只，雄性，2月龄，体重20～25 g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供[许可证号：SYXK（浙）2016-0022]。ICR 小鼠适应性喂养1周，期间保持通气良好，光照12 h/d，室温22～25℃，相对湿度60%～70%，每日给予正常饲料。

1.2 主要仪器与试剂

尿酸（批号：BCCB8477）、次黄嘌呤（批号：SLBZ9513）、氧嗪酸钾（批号：STBH8632）、乙胺丁醇（批号：WXBD 0497V）、羧甲基纤维素钠（批号：BCBN1690V）均购于美国Sigma 化学试剂公司；UA 试剂盒购于宁波普瑞柏生物技术股份有限公司（批号：20200720）；LWC400全自动血生化分析仪（深圳蓝韵医疗科技有限公司）；KITMAN-T24 冷冻离心机（TOMY）；DKZ-2B 型电热恒温振荡水槽（常州诺基有限公司）；SB-5200 超声清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 实验分组及处理

1.3.1 氧嗪酸钾对不同时间点小鼠尿酸的影响取90只ICR 雄性小鼠随机分为1～9 组，每组10只。小鼠禁食6 h 后腹腔注射氧嗪酸钾溶液（300 mg/kg），在腹腔注射后于0 min 对1 组小鼠进行眼眶静脉丛取血、15 min 对2 组小鼠进行取血、30 min 对3 组小鼠进行取血、45 min 对4 组小鼠进行取血、60 min 对5 组小鼠进行取血、90 min 对6 组小鼠进行取血、120 min 对7 组小鼠进行取血、150 min 对8 组小鼠进行取血、180 min 对9 组小鼠进行取血。

1.3.2 氧嗪酸钾联合尿酸对不同时间点小鼠尿酸的影响取70 只ICR 雄性小鼠随机分为1～7 组，每组10只。小鼠禁食6 h 后分别腹腔注射尿酸生理盐水溶液（500 mg/kg）以及氧嗪酸钾溶液（300 mg/kg），在腹腔注射后于0 min 对1 组小鼠进行眼眶静脉丛取血、45 min 对2 组小鼠进行取血、90 min 对3 组小鼠进行取血、135 min 对4 组小鼠进行取血、180 min 对5 组小鼠进行取血、225 min 对6 组小鼠进行取血、270 min 对7 组小鼠进行取血。

1.3.3 氧嗪酸钾联合次黄嘌呤对不同时间点小鼠尿酸的影响取70 只ICR 雄性小鼠随机分为1～7 组，每组10只。小鼠禁食6 h 后分别腹腔注射次黄嘌呤生理盐水溶液（500 mg/kg）以及氧嗪酸钾溶液（300 mg/kg），在腹腔注射后于0 min 对1 组小鼠进行眼眶静脉丛取血、45 min 对2 组小鼠进行取血、90 min 对3组小鼠进行取血、135 min 对4 组小鼠进行取血、180 min对5 组小鼠进行取血、225 min 对6组小鼠进行取血、270 min 对7 组小鼠进行取血。

1.3.4 氧嗪酸钾联合乙胺丁醇对不同时间点小鼠尿酸的影响取90 只ICR 雄性小鼠随机分为1～9 组，每组10 只。小鼠禁食6 h 后腹腔注射氧嗪酸钾溶液（300 mg/kg）并灌胃给予乙胺丁醇溶液（250 mg/kg），在腹腔注射后于0 min 对1 组小鼠进行眼眶静脉丛取血、15 min 对2 组小鼠进行取血、30 min 对3 组小鼠进行取血、45 min 对4 组小鼠进行取血、60 min对5组小鼠进行取血、90 min 对6 组小鼠进行取血、120 min 对7 组小鼠进行取血、150 min 对8 组小鼠进行取血、180 min 对9 组小鼠进行取血。

1.4 观察指标及检测方法

血液样本水浴锅37℃温水浴30 min 后，离心机3500 r/min，离心10 min，吸取上层血清，再3500 r/min离心5 min，取上层血清，使用全自动血生化仪测定尿酸值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，检测结果用均数±标准差（

±s）表示。且将所得结果运用Graphpad Prwasm 5 软件进行作图。

2 结果

2.1 氧嗪酸钾对不同时间点小鼠尿酸的影响

ICR 小鼠腹腔注射给予300 mg/kg 的氧嗪酸钾溶液，通过不同时间段采血来测定尿酸值。在给予氧嗪酸钾15 min 时，与0 min 时的尿酸比较，出现下降的情况；在30～45 min 时尿酸值上升到峰值（上升幅度为36.2%）；在45～60 min 时尿酸值开始下降；在120～180 min 时，尿酸值下降至最低并保持一段时间（图1）。结果说明，氧嗪酸钾溶液的确能在短时间内提高小鼠体内的尿酸水平，但是不能维持尿酸在高水平状态，具有一过性。

图1 氧嗪酸钾对不同时间点小鼠尿酸的影响

2.2 氧嗪酸钾联合尿酸对不同时间点小鼠尿酸的影响

ICR 小鼠腹腔注射给予300 mg/kg 的氧嗪酸钾溶液同时腹腔注射给予500 mg/kg 的尿酸溶液，通过不同时间段采血来测定尿酸值。在给予氧嗪酸钾和尿酸90 min 时尿酸值上升到峰值（上升幅度为207.2%）；在90～135 min 时尿酸值开始下降；在135～270 min时，尿酸值下降至正常水平（图2）。结果说明，在给予氧嗪酸钾并联合尿酸溶液能使小鼠尿酸在短时间内上升，但是同样不能使尿酸水平维持在一个较高的水平。

图2 氧嗪酸钾联合尿酸溶液对不同时间点小鼠尿酸的影响

2.3 氧嗪酸钾联合次黄嘌呤对不同时间点小鼠尿酸的影响

ICR 小鼠腹腔注射给予300 mg/kg 的氧嗪酸钾溶液同时灌胃给予500 mg/kg 的次黄嘌呤溶液，通过不同时间段采血来测定尿酸值。在给予氧嗪酸钾和次黄嘌呤溶液45 min 时尿酸值上升到峰值（上升幅度为384.4%）；在225 min 时，尿酸值下降至正常水平（图3）。结果说明，在给予氧嗪酸钾并联合次黄嘌呤溶液能使小鼠尿酸在短时间内上升，并且上升的幅度相对较高。与氧嗪酸钾联合尿酸模型相比，尿酸下降的速度较慢。

图3 氧嗪酸钾联合次黄嘌呤溶液对不同时间点小鼠尿酸的影响

2.4 氧嗪酸钾联合乙胺丁醇对不同时间点小鼠尿酸的影响

ICR 小鼠腹腔注射给予300 mg/kg 的氧嗪酸钾溶液同时灌胃给予250 mg/kg 的乙胺丁醇溶液，通过不同时间段采血来测定尿酸值。在给予氧嗪酸钾和乙胺丁醇溶液15 min 时尿酸值开始上升；在90 min 时尿酸值上升至峰值（上升幅度为320.8%）；在90～180 min时，尿酸值能一直保持在较高水平（图4）。结果说明，在给予氧嗪酸钾并联合乙胺丁醇溶液能使小鼠尿酸稳定的上升，上升的幅度相对较高，并且能长时间维持尿酸值在较高水平。

图4 氧嗪酸钾联合乙胺丁醇溶液对不同时间点小鼠尿酸的影响

3 讨论

据统计，我国高尿酸患者目前已达1.2 亿，且患病人数逐年增加[9-10]。目前，国内外还没有一个稳定的HUA 动物模型，动物疾病模型在研究人类致病机理中起到了关键作用，HUA 模型的建立对高尿酸药物的预防及药物的筛选及开发有着非常重要的意义。

尿酸是蛋白质消化过程中的副产物，特别是其来源于嘌呤代谢。通常尿酸是通过肾脏排泄的，但是如果由于肾功能不全而不能通过泌尿系统完全清除，则会在关节和肾脏中沉积过多的尿酸，从而导致痛风的发生[11]。痛风是世界范围内的常见疾病，是由于尿酸盐晶体在关节和肾脏中过多沉积所致[12]。在许多生物体中，包括大多数哺乳动物，尿酸被尿酸氧化酶（尿酸酶）代谢为尿囊素[13]。在灵长类动物进化的2 千万～3 千万年中，尿酸酶基因在其启动子和编码区发生了数个独立的突变，导致在灵长类谱系中尿酸酶功能逐渐丧失[14]。由于移码和错义突变，现代人类和高等灵长类动物具有无功能的尿酸酶基因（伪基因）[15]，因此，不能合成有活性的尿酸酶把尿酸代谢为溶解度好的尿囊素通过肾脏排出体外[16-17]，从而使HUA的发生成为可能。小鼠体内存在完善的尿酸排泄系统，可以将尿酸代谢为溶解度好的尿囊素，并通过肾脏排出。所以作为大多数疾病造模首选的模式动物小鼠，在HUA 造模过程中带给人们极大的困难。直到氧嗪酸钾的发现[18]，使得小鼠被普遍运用于HUA 模型。氧嗪酸钾结构与尿酸的嘌呤环相似，可部分抑制尿酸酶的活性，减少尿酸的分解，常被用来诱导产生HUA 模型[19]。

当前国内外常用的一般分为直接补充尿酸模型、增加尿酸前体物质模型、抑制尿酸排泄模型、抑制尿酸分解模型、基因敲除模型和联合模型[20-21]。本研究设计在外加氧嗪酸钾的基础上，即通过氧嗪酸钾来抑制小鼠体内尿酸酶的活性，排出小鼠体内的尿酸酶对尿酸的影响，从而促进小鼠高尿酸模型的建立。冯学轩等[22]建立的急性HUA 模型，并没有对小鼠尿酸值短期的变化进行详细的描述。

本研究结果显示，单一注射氧嗪酸钾，能在短时间内提高小鼠体内的尿酸水平，但是不能维持尿酸的高水平状态，具有一过性，并且此结果也符合王凯等[19]代谢组学的研究。此外，在此研究的基础上又增加了摄入性模型，在注射氧嗪酸钾的基础上，通过灌胃的方式增加小鼠体内尿酸含量，发现小鼠尿酸水平不论在峰值和持续时间上都显著增加，但是由于没有控制小鼠排泄，加上氧嗪酸钾在小鼠体内发挥药效时间短，小鼠尿酸值在短时间内可以恢复正常。另外本研究还选择了次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合造模，发现相比于尿酸，尿酸前体物质次黄嘌呤能使小鼠尿酸在短时间内上升，并且上升的幅度相对较高。跟氧嗪酸钾联合尿酸模型相比，尿酸下降的速度较慢。以上模型虽然可以达到短期急性尿酸值超标的情况，但是持续时间都比较短，给予药物发挥作用的窗口期不好掌握。Zhu 等[23]通过氧嗪酸钾联合乙胺丁醇成功诱导持续时间较长的高尿酸大鼠模型，乙胺丁醇可抑制肾脏对尿酸的排泄，导致血尿酸水平升高。本研究发现，利用氧嗪酸钾联合乙胺丁醇也可以诱导小鼠高尿酸模型，小鼠尿酸稳定上升，上升的幅度相对较高，并且能长时间维持尿酸值在较高水平，且临床研究结果表明，90%的原发性HUA 属于尿酸排泄不良型[24]。本研究发现通过不同造模手段的比较，对于急性高尿酸模型的构建，氧嗪酸钾联合乙胺丁醇效果较为突出，不仅使尿酸上升平稳，对小鼠产生的应急反应小，而且持续时间长，建立的动物模型更符合临床需要。

综上所述，动物模型对于研究疾病的发病机理以及治疗疾病的新药研发尤其重要，本研究采用腹腔注射氧嗪酸钾的方法成功地诱导了HUA 小鼠急性模型，并且探究了氧嗪酸钾联合尿酸、次黄嘌呤以及乙胺丁醇的小鼠高尿酸模型造模方式。本研究在短时间内造模剂造模后，小鼠体内高尿酸的动态变化过程进行了详细的探究，为HUA 的研究奠定基础，对HUA发病机理和新药研发的动物模型选择提供参考。

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