人恶性黑色素瘤是一类皮肤恶性肿瘤，有迁移快、病情发展迅速等特点，由黑色素细胞发展形成，且使用化疗药物治疗时易产生耐药[1]。早期该病可通过手术切除而实现根治，但由于其转移快，且发病较隐匿，发现时往往已是中晚期[2]。MTH1基因在肿瘤发展、转移等方面起着非常重要的作用，且在多类肿瘤细胞中均发现该基因处于高表达状态。MTH1基因所表达的酶可修复肿瘤细胞中高表达的活性氧（reactive oxygen species，ROS）所产生损伤[3]。MTH1基因可能在肿瘤存活中扮演着非常重要的角色，因此通过抑制该基因表达可能有助于治疗肿瘤等。本研究通过观察MTH1抑制剂TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、迁移的抑制作用，以探讨其作用效果及机制，现报道如下。

人恶性黑色素瘤细胞株A375购自中国协和医科大学细胞中心，并于蚌埠医学院药理学实验室冻存。CCK-8试剂购于北京安必奇生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶、DMEM高糖及胎牛血清均购于美国Gibco公司；96孔细胞培养板、6孔细胞培养板细胞培养瓶均购于Corning公司；磷酸缓冲盐溶液（PBS）、4%多聚甲醛购于北京欧普特科技有限公司；TH588购于美国Selleck公司；酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；CO2培养箱购于德国Binder公司。

A375细胞放置于37℃、5%的CO2培养箱中，DMEM培养基含10%胎牛血清进行培养，0.25%胰蛋白酶每2～3天进行1次消化传代。

倒置显微镜法观察细胞形态，取对数生长期细胞接种于6孔板，浓度2×105/孔，并置于培养箱中培养24 h后用不同浓度梯度TH588（0、4、8、16、3 2、64 μmol/L）干预，24 h后采用倒置显微镜观察形态并摄像。

取对数生长期细胞接种于96孔板，浓度7000/孔，并置于培养箱培养24 h，随后弃去培养液，将不同浓度梯度TH588（0、4、8、16、32、64 μmol/L）加入处理，并设立阴性对照组，设置调零孔，每组5个复孔，药物加入培养24、48、72 h后于每孔加入10 μL CCK-8，并置于37℃培育1 h，使用酶标仪于450 nm处测定每孔的吸光度（OD）值，细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

取对数生长期细胞接种于6孔板，浓度1×104/孔，24 h培养结束后弃去培养液，加入含空白及高（12.8 μmol/L）、中（6.4 μmol/L）、低浓度（3.2 μmol/L）TH588细胞，于培养箱中培养5 d后有细胞集落形成，随后弃去培养基，用PBS洗涤2遍，并用4%多聚甲醛于-20℃固定15 min，然后室温下用结晶紫染色10 min，再用PBS洗涤2遍，干燥后观察集落情况并拍照。

取对数生长期细胞接种于6孔板中，浓度为5×105/孔，6孔板背部与横轴垂直且每隔0.5～1.0 cm便标记一次。生长至90%融合后用20 μL移液枪垂直板面，通过标记进行划痕。之后用PBS洗涤2遍，弃去划下的漂浮细胞，将含TH588的无血清培养基放入，设立空白对照，并保持培养环境在37℃及5%CO2。于0、48 h拍照。

不同浓度TH588在作用于A375细胞24 h后于倒置显微镜下观察，结果显示，使用TH588浓度越低，细胞越清楚，且更为饱满，生长更为旺盛，与其他细胞间的间隙更小；而随着浓度增加，细胞饱满度变差，且边缘越来越模糊，胞间隙增大，有碎片及颗粒出现（图1）。

 

图1 TH588对人恶性黑色素瘤细胞形态的影响（100×）

CCK-8检测结果显示，TH588的浓度越高、作用时间越长，其对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖抑制效果越好（图2）。

 

图2 TH588对A375细胞存活率的影响

同一时间段，各浓度TH588组与空白对照组（0 μmol/L）比较，A375细胞存活率均降低；32、64 μmol/L TH588浓度下培养48、72 h时A375细胞存活率均低于同TH588浓度下培养24 h时（表1）。

表1 不同TH588浓度不同培养时间A375细胞的存活率（%）

通过空白及高中低三种浓度TH588作用于A375以进一步观察其抑制增殖效果，结果显示，低浓度TH588便可抑制A375细胞集落克隆形成，且浓度增高抑制效果越好，克隆数量越少（图3）。

 

图3 TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞集落克隆形成的抑制效果

A：0 μmol/L TH 588；B：3.2 μmol/L TH 588；C：6.4 μmol/L TH 588；D：12.8 μmol/L TH588

培养48 h后，0 μmol/L浓度组迁移距离明显，而随着TH588浓度升高，迁移距离亦越来越短，且8及16 μmol/L组均有细胞变圆脱落，游离至间隙，划痕迁移距离较0 μmol/L均更低（图4）。

 

图4 0、48 h不同浓度TH588对A375细胞迁移的影响

TH588可选择性地作用于MTH1基因的表达过程，从而阻止相应蛋白质的产生，而MTH1基因在人类第7号染色体p22上，通过表达可产生修复ROS造成损伤的酶，在肿瘤的增殖、迁移等过程中发挥重要作用，而正常细胞通常不依赖于MTH1的功能[4-5]。Patel等[6]研究指出，MTH1在介导调控原癌基因KRAS中发挥重要作用，因此通过抑制MTH1基因表达，可对KRAS基因突变所诱导的肿瘤的发生发展有一定阻碍效果。MTH1基因不仅在人恶性黑色素瘤发生发展过程中发挥作用，在肺部肿瘤、卵巢肿瘤等多类肿瘤发生发展过程中均有参与[7]。抑制MTH1基因可对肿瘤发展起到抑制作用，且对正常细胞无太大影响，因此MTH1的特异性抑制剂研究前景较好[8]。本研究中，集落克隆形成抑制实验及细胞划痕实验等方法发现MTH1抑制剂TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖及迁移均有明显的抑制效果，提示一定浓度的TH588对黑色素瘤细胞的恶化及转移有抑制作用，有助于改善该病的预后。人恶性黑色素瘤易发生转移，表型易发生变化，且治疗手段较为局限，因此病死率高，目前临床主要通过手术治疗配合维生素、维甲酸等药物辅助治疗。代强等[9]研究指出，在传统治疗的基础上应用生物免疫方法治疗人恶性黑色素瘤是今后发展的主要方向。

由于癌病发病机制复杂，因此目前临床正尝试联合不同作用机制的药物共同治疗，使用分子靶向药物与化疗药物联合、不同机制的化疗药物联合等多种方法均能得到良好的抗肿瘤效果[10-16]。转移是恶性黑色素瘤治疗中的一大要点，若处理不善，极易复发或治疗失败。董永等[12]研究指出，近年来小分子靶向药物及免疫治疗药物的出现大大提高了恶性黑色素脑转移的疗效。本研究结果显示，同一时间段各浓度TH588组与空白对照组比较，细胞存活率均降低，提示A375细胞对TH588敏感性较高，低浓度便可得到较好的效果。倒置显微镜法观察TH588作用于人恶性黑色素瘤A375细胞后，细胞明显皱缩，且边缘变得模糊，有碎片颗粒产生，提示TH588对人恶性黑色素瘤的抑制作用明显，能阻止肿瘤细胞的愈合，可能是由于TH588抑制了MTH1基因的修复功能。

综上所述，TH588对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖及迁移有明显抑制作用，可能与其抑制MTH1修复ROS损伤功能的作用有关，且低浓度TH588便有较好的抑制效果。

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Effect of MTH1 inhibitor TH588 on the proliferation and migration of human malignant melanoma A375 cells

HUO Ji-wu1 LI Guang-zao1▲LI Lu2 XIONG Zhu-you1 LI Wei1
1.Department of Burn Plastic Surgery,the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui Province,Bengbu 233000,China;2.Pharmacy Intravenous Admixture Service,the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui Province,Bengbu 233000,China

[Abstract]Objective To investigate the effect of MTH1 inhibitor TH588 on the proliferation and migration of human malignant melanoma A375 cells.Methods Cell culture method was used to culture human malignant melanoma A375 cells,the inverted microscope method was used to observe the influence of TH588 on cell morphology,and the CCK-8 method was used to detect the inhibitory effect of different concentrations of TH588(0,4,8,16,32,64 μmol/L)on the proliferation of A375 cells.The colony cloning inhibition test was used to observe and compare the proliferation inhibition effect of TH588 on A375 cells at three concentrations(12.8,6.4 and 3.2 μmol/L),cell scratch experiment was used to detect the effect of TH588 on the migration ability of A375 cells.Results The CCK-8 test results showed that the cell survival rate of the TH588 groups with different concentrations at the same time period was lower than that of the blank control group.The cell survival rate at the concentration of 32 and 64 μmol/L TH588 at 48 and 72 h was lower than that at 24 h.The results of the inverted microscope method showed that after TH588 acted on human malignant melanoma A375 cells,the cells shrank significantly,the edges became blurred,and debris particles were produced.Colony cloning inhibition test showed that TH588 had a significant inhibitory effect on the proliferation of human malignant melanoma A375 cells.The cell scratch experiment showed that the scratch migration distance of A375 cells after TH588 was shorter than that of A375 cells without intervention within 48 h.Conclusion TH588 has a significant inhibitory effect on the proliferation and migration of human malignant melanoma A375 cells,and low concentration TH588 has a better inhibitory effect.

[Key words]MTH1 inhibitor TH588;Human malignant melanoma;A375 cells

[中图分类号]R739.5

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2021）5（c）-0077-04

[作者简介]霍继武（1986-），男，山东淄博人，硕士，主治医师，研究方向：体表的肿瘤的诊断及治疗

▲通讯作者：李光早（1964-），男，安徽六安人，本科，主任医师，研究方向：体表的肿瘤的诊断及治疗

（收稿日期：2020-09-03）