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脐带血是胎儿娩出断脐后从脐静脉中采集的血液，其中富含造血干细胞、间充质干细胞等多种干细胞及免疫细胞，根据国家卫健委发布的《造血干细胞移植技术规范（2017年版）》[1]，脐带血造血干细胞治疗技术的临床应用适应症包括：①恶性疾病：急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、淋巴瘤及其他某些恶性肿瘤等；②非恶性疾病：再生障碍性贫血、重症放射病、重型地中海贫血等；③部分遗传病、先天性疾病及代谢性疾病。至2020年9月，据美国国家骨髓捐献者计划的统计数据，全球已有约54家机构可提供超过797 000份脐带血，完成约35 000例脐带血移植[2-3]。临床需求的扩大和移植技术的提升促进了脐血库的建立和发展，也推动着脐带血制备工艺和制备效率的不断改进提高。本研究旨在探讨三联袋转移法在脐带血制备中的应用效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2019年4月～2020年7月广州脐血库的脐血处理数据，按照分离方法分为传统法组（267份）和转移法组（278份），共计545份脐血的相关数据为研究对象。此阶段脐血库的运行环境、关键设备、主要技术人员均相对稳定，数据具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器

6%羟乙基淀粉生理盐水注射液（HESPAN）购自美国B.Braun公司，批号：J9D 200；联合冷冻保护剂[Cryo Sure-DEX40，含有55%二甲基亚砜（DMSO）及5%右旋糖酐-40]购自德国WAK-Chemic公司，批号：USP7D4S；甲基纤维素半固体培养基购自加拿大Stemcell公司，批号：18M 98047；台盼蓝溶液购自Sigma公司，批号：TRB 0850；流式抗体：CD45-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD34-藻红蛋白（PE）、免疫球蛋白（IgG）-PE购自美国BD公司，批号：8311690、8341967、 9015728；一次性采血三联袋（1个含血液保存液Ⅲ的母袋、1个空转移袋、1个红细胞保存液袋），购自费森尤斯卡比（广州）医疗用品有限公司，批号：85NB14AE 00；生物洁净工作台购自苏州苏静安泰空气技术有限公司，型号：BCM-1600A；大容量低温离心机SORVALL

购自德国Thermo Fisher公司，型号：RC-3BP+；流式细胞仪购自美国BD公司，型号：BD FACS CantoⅡ；血细胞分析仪购自美国贝克曼库尔特公司，型号：Ac.T diff2，程序降温仪购自英国Planer公司，型号：Kryo- 550；高频热合机购自韩国Centron公司，型号：SE260/ 200；CO2培养箱购自德国Labotect公司，型号：C 200；倒置显微镜购自日本Olympus及Nikon公司，型号：CHK及TE 300；分浆夹购自苏州医疗仪器公司，型号：FJ-11。

1.3 方法

1.3.1 传统法工作人员在无菌操作间接收采集好的脐带血，核对相关信息并录入数据库。仔细检查血袋内有无任何血块或透明凝块，根据公式计算出脐带血体积及需要的羟乙基淀粉（HES）用量，HES用量（mL）=脐带血总体积/4。无菌操作下，将HES注入脐带血袋，用止血钳夹住针孔部位，然后用热合机封管。充分混匀3 min。置4℃条件下，静置30 min后，以450 r/min离心6 min（离心半径22.1 cm）。从离心机内小心取出血袋挂到超净台内的钩子上，管上夹上止血钳和控速夹，折断堵塞装置（需左右折断两次，使堵塞装置内芯呈游离状态）。静置5～10 min。松开止血钳，调整控速夹，使采血袋内的红细胞层缓慢流入空转移袋内，速度大约控制在0.15 g/s。当残留红细胞层距离采血袋底端剩余1.5 cm左右时，用止血钳终止转移。利用转移袋内的空气使管中的血液回流至采血袋内。取下止血钳用小管夹夹紧管口，然后将血袋直立放入低速冷冻离心机内，置4℃条件下，以1350 r/min离心13 min（离心半径22.1cm）。从离心机内小心取出血袋，静置30 min以上，然后将血袋置于分浆夹上，转移管上夹上止血钳和控速夹。取下转移管上的止血钳，控制血浆流速约0.3 g/s。注意观察血袋内血浆与红细胞层的位置，当血袋内剩余少量血浆时，用止血钳终止血浆转移。将浓缩后的脐带血转移至冷冻袋内，放入4～8℃冰箱预冷10 min，然后加入冷藏的联合冷冻保护剂，并抽出冷冻袋内多余的空气，以热合机封口后，置于程序降温仪内，运行至-100℃后，放入液氮中保存。

1.3.2 转移法在血袋内加入HES，充分混匀3 min后，将血袋挂到超净台内的钩子上，折断堵塞装置，使血液在重力作用下全部流入空转移袋，然后用止血钳阻断转移袋出口。此时，将红细胞保存液袋的堵塞装置折断，将约5 mL红细胞保存液注入原血袋，充分混匀，使附着在原血袋的残留脐血也尽量洗脱下来，必要时可重复洗涤1～2次。松开止血钳，将此部分血液一并流入转移袋。此时，用小管夹分别阻断转移袋与原血袋及红细胞保存液袋之间的通路，转移过程完成。之后与“1.3.1”传统法相同，置4℃条件下，静置30 min后，开始第一次离心，完成余下各步骤。

1.3.3 样本检测每份脐带血在制备前后均计算体积，并留取足量样本进行相关检测。

有核细胞和红细胞计数：采用全自动血细胞分析仪进行检测。读取屏幕上显示的白细胞（WBC）数值，细胞总数=WBC×采样时脐血体积。有核细胞回收率=（分离后细胞数/分离前细胞数）×100%，红细胞去除率=（1-分离后红细胞数/分离前红细胞数）×100%。

CD34阳性细胞计数：标记流式管，设同型对照，脐血样本各50 μL分别加入对照管及实验管，对照管加入10 μL CD45-FITC及10 μL IgG-PE荧光抗体，实验管加入10 μL CD45-FITC及10 μL CD34-PE荧光抗体，室温避光孵育20 min后加入红细胞裂解液，于室温继续避光孵育10 min，以1500 r/min离心5 min（离心半径18.5 cm），弃上清，加入2 mL PBS，洗涤细胞，以1500 r/min离心5 min（离心半径18.5 cm），弃上清，再加入500 L PBS，上机检测。分析结果得到CD34阳性细胞占CD45阳性的有核细胞的百分比，再根据分离后脐血成品的细胞总数，计算出每份脐血中的CD34阳性细胞的数量。

造血祖细胞集落分析：采用Method Cult半固体甲基纤维素培养基（加拿大Stem Cell公司，GFH4434），以105个细胞/mL的密度接种于12孔板中，每孔终体积1 mL，每标本设双复孔。置37℃、5% CO2饱和湿度下培养14～16 d。倒置显微镜下对粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、爆式红细胞集落形成单位（BFU-E）和粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位（CFU-GEMM）分别计数，求和得到每105个细胞中的祖细胞集落的个数，再根据分离后脐血成品的细胞总数，计算出每份脐血中的祖细胞集落的数量。

1.4 观察指标

选择能反映转移法应用前后制备质量的参数，包括脐血冻存体积、红细胞去除率、有核细胞数量和回收率、CD34阳性细胞数量及祖细胞集落数量为观察比较的指标。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 两组脐血的体积的比较

两种方法制备的脐血初始体积（分离前体积）基本相似，差异无统计学意义（P＞0.05），而转移法分离后的脐血体积（脐血冻存体积）低于传统法，体积减少率高于传统法，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两种方法制备的脐血体积的比较（

±s）

2.2 两组脐血的红细胞去除率的比较

两种方法制备的脐血初始红细胞数量（分离前红细胞）基本相似，差异无统计学意义（P＞0.05），而转移法分离后的红细胞数量高于传统法，差异有统计学意义（P＜0.05），但两者的红细胞去除率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 两种方法制备的脐血红细胞去除率的比较（

±s）

2.3 两组脐血的主要质量参数的比较

两组脐血的分离前有核细胞数、分离后有核细胞数、有核细胞回收率、分离后CD34阳性细胞的数量基本相似，差异无统计学意义（P＞0.05），而转移法分离后祖细胞集落的数量高于传统法，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 两种方法制备的脐血主要质量参数的比较（

±s）

3 讨论

在不影响细胞回收率的前提下，科学、有效地分离脐带血中的有核细胞，减少冻存体积，实现制备过程的标准化及可重复性，是脐血库的建立和发展过程最为关键的技术之一[4-6]。与骨髓和外周血干细胞的供者资料库不同，脐血库是将干细胞产品以实物形式深低温（-196℃）长期冻存，削减冻存体积意味着减少冷冻保护剂DMSO的用量，降低回输时可能引起的不良反应；节约储存空间，便于保存数量更充足、多态性更丰富的脐血，从而满足更多患者的移植需求。

手工分离法和仪器分离法是目前行业内最常见的两种脐带血制备方法。采用干细胞分离仪分离的优点是适用于大批量样本处理，分离的终体积和主要指标可以预设，分离后的质量较为稳定一致，不受人为干扰。但无论何种品牌的分离系统，但都需要特制的套袋、离心杯或小型分离装置，设备和耗材较为昂贵，且对于特殊体积（过大或过小）的样本，需要额外处理[7]。传统的手工法多采用HES沉降法、淋巴细胞分离液（Ficoll）分离法、自然沉降法等，使红细胞向下沉降，脐血中富含的有核细胞层在密闭状态下分离聚集在上层，收集后转移入冷冻袋，加入冷冻保护剂，再降温处理，最终保存于-196℃的液态氮中[8-10]。手工法对工作人员技术能力和经验要求较高，但方便灵活、经济实用，尤其适于样本量不大、人员相对固定的脐血库采用。广州脐血库1998年6月～2020年7月采集的脐血约16 800份，保存脐血近7000份。为使更多高品质的脐带血实现长期冻存，自2019年11月起，对传统的HES法进行改良。与传统法比较，改良后的转移法的脐血平均冻存体积下降，红细胞去除率未受影响，总有核细胞数、有核细胞回收率、造血指标CD34阳性细胞数量无显著变化，而祖细胞集落数量增加，说明转移法有助维持脐带血产品的造血能力。同时，转移法与传统法的各项数据的标准差也较为接近，表明转移法的分离体系也是稳定可靠的。

转移法的优势主要有以下方面。首先，传统法是将HES加入母袋的脐血中，充分混匀、静置后就进行离心；而转移法是在加入沉降剂混合后，掰断母袋上堵塞装置，将脐血导入另一空转移袋中，再静置离心。转移袋与母袋形似，但袋体略窄，顶部仅有一个流出口（母袋有两个），平滑圆钝。在倒置离心后的红细胞去除过程中，袋体窄小平直的结构，使聚集的红细胞层在缓慢流出接近转移袋底部时，仍能保持清晰的界面，有利于工作人员把握有核细胞层下方保留约1.5 cm红细胞层的尺度，在不影响回收率的情况下，最大限度地去除红细胞层，从而减少脐血成品体积。其次，在将含有HES的脐血导入转移袋后，再将红细胞保存液袋中的保养液约5 mL转移至母袋，充分混匀，并可重复操作，可以将母袋中残存的脐血一并导入转移袋，减少了细胞附着在袋壁上引起的细胞丢失。由于红细胞保养液中含有甘露醇，可增加细胞膜稳定性，防止溶血，有利于后续分离过程中有核细胞的回收。最后，本库采集的脐带血主要来自顺产产妇，与剖宫产产妇比较，顺产产妇可能因情绪紧张、痛感强烈，血管痉挛而影响脐带血采集；同时，顺产产妇容易出现胎盘剥离时间延长、脐带损伤等异常，导致脐血发生凝血，顺产脐带血往往体积偏小并混有凝块[11-12]。转移法在样本制备过程中，先将脐血通过母袋的堵塞装置导入转移袋，可以有效过滤肉眼可见的凝块，将其留在母袋中，不影响后续的样本处理；传统法对含有凝块的脐带血通常只能废弃。因此，转移法有利于降低脐血采集的废弃率，提高脐血制备效率。

总之，转移法不需要增加试剂耗材、离心次数，只是在分离过程中增加一次样本转移，基本不影响制备时长。随着工作人员经验的积累和熟练程度的提高，转移法的应用日趋成熟。目前，脐血的平均冻存体积、平均RBC去除率及有核细胞回收率等，接近甚至优于国外[13-17]及国内[18-21]的相关研究报道。当然，这些研究的目的多为手工法和仪器法进行比较，设备、环境、方法与本实验不尽相同。本研究中，转移法分离后的脐血红细胞数量与传统法比较，有所增加，可能与在压缩体积时保留了更多的红细胞而非血浆层有一定关系，需要今后进一步积累经验，改进方法。另外，与细胞分离仪使用的套袋比较，手工分离体系仍然是沿用一次性塑料血袋，若能对其进行工艺改造，如采用外形更狭长、材质更牢固的袋体，或在母袋与转移袋之间的管路上增加可以阻挡凝块的过滤筛等，可改善分离效率，有助于这种简单、经济、实用方法的推广。

综上所述，转移法步骤简便可行，无须增加成本，促进脐血制备质量的提高，具有实际应用价值。

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