外阴硬化性苔藓是一种外阴上皮内非瘤样病变，属于慢性炎症性皮肤病，临床表现为外阴皮肤及黏膜变白、萎缩，伴有不同程度的瘙痒、疼痛等特征，严重影响患者的身心健康，重者累及生殖器及肛周。目前具体病因尚不清楚，可能与免疫、遗传、内分泌、代谢和氧化应激等有关[1-2]，据相关报道，外阴硬化性苔藓有发展为外阴癌的趋势（发生率约4%）[3-4]。S100 蛋白家族包含21个低分子量酸性钙离子结合蛋白，具有特殊的EF 手型结构，在组织中参与钙离子对信号的传导过程，从而可调节如信号转导、细胞周期调整等多种细胞生物学活动，由于其属于钙传感器，可助于细胞增殖和移动、运输和分化等多种分子生物过程[5]。多数S100 蛋白家族成员在多种肿瘤形成过程中出现异常表达，究其原因为该家族中多数成员均定位于染色体1q21 区带，此区带的特点为稳定性差，较易发生与肿瘤关系密切的染色体的缺失、易位、重叠等改变[6-7]。S100A8（又称calgranulin A，MRP8）、S100A9（又称calgranulin B，MRP14）与S100A4 是S100 蛋白家族较为重要的成员，其中S100A8 和S100A9 在体内多以钙离子依赖性方式形成同/异二聚体复合物，S100A8/A9 表达失调与几种常见的人类恶性肿瘤相关，S100A4 可以促进肿瘤转移，S100A4 高表达往往提示肿瘤预后不良[5]。但其与外阴硬化性苔藓之间是否存在特殊的关联尚不明确，因此，本研究将检测S100A8/A9 及S100A4 在外阴硬化性苔藓中的表达情况，探讨S100A8/A9 及S100A4 与外阴疾病之间的关系，现报道如下。

石蜡标本取材于中国医科大学附属第一医院妇科门诊2008年1月～2018年1月经手术切除的30例外阴硬化性苔藓患者的病理组织，患者年龄35～78岁，平均（55.8±3.6）岁。外阴硬化性苔藓患者病灶位于会阴，以两侧大阴唇为主，术前均未曾接受过药物、激光等治疗。

另选取来源于中国医科大学附属第一医院妇科病房2013年1月～2018年1月需行子宫脱垂等阴式手术的10例患者的外阴正常皮肤。患者年龄55～86岁，平均（65.8±2.8）岁。

两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究所有病理取材及研究方法均已经中国医科大学附属第一医院医学伦理委员会审核批准。患者均知晓本研究情况。

石蜡切片厚度4 μm，常规进行抗原修复，步骤为脱蜡、水化，柠檬酸缓冲液高温高压，PBS 反复浸洗，滴加过氧化物酶阻断液，滴加一抗（S100A8/A9、S100A4均购置于美国Santa Cruz 公司，工作浓度分别为1∶50、1∶100），4℃过夜，再次PBS 浸洗后，滴加二抗（北京博奥深生物工程有限公司），37℃孵育30 min，DAB 显色（北京博奥深生物工程有限公司），苏木素复染，脱水透明，中性树脂封片。PBS 代替一抗作阴性对照。

标本采用SABC 免疫组织化学方法检测，观察免疫组化染色结果，分析比较外阴硬化性苔藓、外阴正常皮肤标本中S100A8/A9、S100A4 蛋白的表达情况。

结果判定：观察光学显微镜下染色情况，以细胞浆及细胞核出现黄色或棕黄颗粒者为阳性细胞，利用显微图象分析系统Meta Morph（UIC/OLUMPUS.US/JP）进行积分光密度值测定，每张切片随机抽取5个不同视野，计算同一张切片的平均积分光密度值并进行结果判断。

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

S100A8/A9 蛋白在细胞核及细胞浆表达形式呈棕黄色颗粒。在外阴正常皮肤中，S100A8/A9 阳性细胞多位于基底细胞层。而在外阴硬化性苔藓中，S100A8/A9 阳性细胞多位于表皮近全层（图1，封三）。

S100A4 蛋白在细胞核及细胞浆表达形式呈棕黄色颗粒。在外阴正常皮肤中，S100A4 阳性细胞多位于基底细胞层，真皮层有少量间质细胞阳性表达。而在外阴硬化性苔藓中，S100A4 阳性细胞仍位于基底层，间质细胞近阴性表达（图2，封三）。

 

图1 外阴硬化性苔藓、外阴正常皮肤标本中的S100A8/A9 免疫组化染色结果（SABC法，400×）

A：外阴正常皮肤；B：外阴硬化性苔藓

 

图2 外阴硬化性苔藓、外阴正常皮肤标本中的S100A4 免疫组化染色结果（SABC法，400×）

A：外阴正常皮肤；B：外阴硬化性苔藓

外阴硬化性苔藓标本中的S100A8/A9 阳性细胞光密度值高于外阴正常皮肤标本，差异有统计学意义（P<0.05）。外阴硬化性苔藓、外阴正常皮肤标本中的S100A4 阳性细胞光密度值比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 外阴硬化性苔藓、外阴正常皮肤标本中S100A8/A9、S100A4 阳性细胞光密度值的比较（±s）

S100A8、S100A9 均属于S100 蛋白家族，又名钙卫蛋白，在体内多以钙离子依赖性方式形成同/异二聚体复合物。S100A8/A9 主要分布于脾脏、肺脏和皮肤等器官及组织中，具有生长抑制、诱导细胞凋亡等功能，表达于嗜中性粒细胞、单核细胞、角化细胞等的胞浆和细胞外液中[8-9]，本研究结果显示，S100A8/A9蛋白表达于正常外阴表皮的多数基底细胞和少数近基底细胞，说明S100A8/A9 参与正常外阴表皮基底细胞的代谢调节。而在外阴硬化性苔藓中发现S100A8/A9 在表皮全层均有表达，统计学分析结果显示，外阴硬化性苔藓标本中的S100A8/A9 阳性细胞光密度值高于外阴正常皮肤标本，差异有统计学意义（P<0.05），提示S100A8/A9 参与外阴硬化性苔藓的病变过程。Yui 等[9]研究发现，RNA 干涉抑制S100A8 基因表达，使Bcl-2 基因表达发生改变，但对APAF-1 mRNA表达却无明显影响，调节线粒体介导的细胞凋亡通路的关键点是Bcl-2 蛋白家族，结果提示，Bcl-2表达调节细胞凋亡可能是通过影响S100A8 发挥作用。S100A8/A9 的促凋亡功能和细胞毒性作用，依赖于其螯合锌的能力，使用S100A8/A9 或阻止锌通过膜的螯合剂二乙烯三胺五乙酸（diethylenetriamine-pentaacetic acid，DTPA），使细胞内锌离子浓度降低，可导致csapase 3 活性降低。在鼠纤维原细胞和癌细胞中S100A8/A9 诱导凋亡的研究早已有报道，这种凋亡诱导效应依赖于蛋白的从头合成途径以及不同的二价阳离子（锌或铜离子）的灭活作用[10]。S100A8/A9 复合体可以一种锌离子可逆转的方式诱导肿瘤细胞和正常成纤维细胞凋亡，还可通过锌离子非依赖性机制发挥凋亡效应，虽然个别S100 蛋白也有锌结合力，但S100A8/A9 是更强大的凋亡诱导剂[11]。另外，S100A8/A9 的诱导凋亡作用能被抗氧化剂所逆转，S100A8/A9很可能具有促氧化作用，从而施加其促凋亡作用。进一步提示外阴硬化性苔藓病变过程可能与S100A8/A9 诱导Bcl-2 表达，锌非依赖性机制和促氧化作用有关。

S100A4 属于S100 蛋白家族另一重要家族成员，又称钙结合蛋白18A2、42A、转移相关蛋白Ntsl[12]、Pel98、成纤维细胞特异蛋白（fibroblast-specificpro-tcinl，FSPL）等，蛋白组成包含101个氨基酸，已被归类为转移相关蛋白[13]。在人体中，S100A4 蛋白主要在单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中表达，角质细胞、黑色素细胞、郎罕氏细胞及汗腺细胞中存在表达。本研究结果显示，S100A4 表达于正常外阴表皮的基底细胞中，进一步证实S100A4 可能参与正常表皮角质细胞的代谢。外阴硬化性苔藓、外阴正常皮肤标本中的S100A4阳性细胞光密度值比较，差异无统计学意义（P>0.05），阳性细胞仍位于基底细胞层，提示S100A4 没有参与外阴硬化性苔藓的病变过程。但在相关研究中[14]发现，S100A4 在早期外阴硬化性苔藓真皮浅层的表达明显高于进展期。Chen 等[15]在肝纤维化的研究中发现，通过上调c-Myb S100A4，可能激活肝星形胶质细胞产生胶原蛋白、透明质酸等细胞外基质，导致此类物质在肝脏组织中沉积，因此促进肝纤维化。还有研究发现S100A4 与皮肤、肾脏和肺的纤维化有关[14]。因此，S100A4 在早期外阴硬化性苔藓真皮层中高表达，可能与晚期均质带的形成有关。

综上所述，S100A8/A9 蛋白高表达与与外阴硬化性苔藓的病变过程有关，S100A4 可能与外阴硬化性苔藓的病变过程无明确相关性，但可能与外阴硬化性苔藓晚期均质带的形成有关。

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Expression and significance of S100A8/A9 and S100A4 in vulvar sclerosing mosses

CHEN Xiao-dan1 MENG Fei1 WU Xin2▲
1.Department of Obstetrics,Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110024,China;2.Department of Gynaecology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Liaoning Province,Shenyang 110001,China

[Abstract]Objective To detect the expression of S100A8/A9 and S100A4 in vulvar sclerosing mosses,and to explore the relationships between S100A8/A9,S100A4 and vulvar sclerosing mosses.Methods Thirty surgical specimens were collected from the Department of Gynecology of the First Affiliated Hospital of China Medical University from January 2008 to January 2018 in patients with vulvar sclerosing mosses.The normal vulva skin samples of 10 patients who needed vaginal surgery such as uterine prolapse from January 2013 to January 2018 were selected from the Gynecological Ward of the First Affiliated Hospital of China Medical University.The samples were detected by SABC immunohistochemistry.The expression of S100A8/A9 and S100A4 were analyzed.Results In normal skin of vulva,S100A8/A9 positive cells were mostly located in basal cell layer,and the optical density of S100A8/A9 positive cells was 0.7946±0.1369.However,in vulvar sclerosing mosses,S100A8/A9 positive cells were mostly located near the whole layer of epidermis,and the optical density of S100A8/A9 positive cells was 1.6206±0.4312.The optical density of S100A8/A9 positive cells in vulvar sclerosing mosses was higher than that in normal vulva skin,and the difference was statistically significant (P<0.05).In normal skin of vulva,S100A4 positive cells were mostly located in basal cell layer,and a small amount of stromal cells were positively expressed in dermis.The optical density of S100A4 positive cells was 0.3020±0.1266.However,in mosses sclerosing vulva,S100A4 positive cells were still located in the basal layer and were negatively expressed in the interstitium.The optical density of S100A4 positive cells was 0.3583±0.1575.There was no significant difference in the optical density of S100A4 positive cells between mosses sclerosing vulva and normal vulva skin samples (P>0.05).Conclusion S100A8/A9 take a part in the pathological process of vulvar sclerosing mosses,however S100A4 may not have definite correlation with the pathological process of vulvar sclerosing mosses.

[Key words]S100A8/A9;S100A4;Vulvar sclerosing mosses;Immunohistochemistry

[基金项目]国家自然科学基金资助项目（30973190）

（收稿日期：2020-10-15）