羟苯磺酸钙（calcium dobesilate，CaD）具有调节和改善毛细血管通透性和柔韧性的作用，可改善糖尿病或者非糖尿病患者微血管病变。临床中，该药物主要用于治疗原发性静脉曲张和慢性静脉功能不全、静脉炎、血栓性综合征[1-4]。斑马鱼作为一种常用的动物模型，主要被应用于胚胎及胚胎早期存在的微血管发生的机制研究。经过药物筛选，发现其模型对药物毒性的评价结果与人体实验的一致性达到80%。越来越多的研究显示，斑马鱼模型已经被较广泛地应用于药物的毒性、安全性评价相关的研究[5-6]。本研究旨在观察CaD对高糖斑马鱼胚胎微血管发生的影响，进一步阐述CaD 的抗血管新生作用，同时为CaD 在临床中的应用提供实验依据。

实验所用斑马鱼为野生型AB 品系VEGF-R2（Flk1）转基因型，购自国家斑马鱼资源中心。选用雌雄比例为1∶2 的成年斑马鱼15 尾（30～35 周龄），全长40～50 mm。

CaD 购买自中国食品药品检定研究院，DMSO 配成母液保存。

内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（VRI，货号S1119）购自Selleck Chem 公司；葡萄糖（上海生工，货号A600219）、无水乙醇（广试化工）、氢氧化钠（上海生工）、氯化钾（上海生工）、硫酸镁（上海生工）、磷酸二氢钠（上海生工）、磷酸二氢钾（上海生工）、碳酸氢钠、氯化钠（阿拉丁试剂）均为分析纯；三卡因（货号MS222）购自Sigma 公司；逆转录试剂盒（Takara，大连）；荧光定量PCR 试剂盒（Takara，大连）；普通PCR 仪（杭州晶格）；斑马鱼循环水养殖系统；恒温培养箱（LRH-250Z型）购自广州瑞明仪器有限公司；体式荧光显微镜（ZOOMV16型）购自ZEISS 公司；酶标仪（瑞士TECAN）；荧光定量PCR（ABI9700）；胚胎血管内皮生长因子（VEGF）、一氧化氮合酶（NOS）ELISA 试剂盒（R&D 公司）。

根据Brand 等提出的方法配制斑马鱼繁育所需循环养殖水，水温（28.0±0.5）℃，pH值为7.0～7.2，电导率为500～650 μS/cm，周期为14 h/10 h（光照/黑暗）。按照雌雄1∶2 比例将斑马鱼进行配对产卵，受精后10 min 内置于干净无菌、含有亚甲蓝孵化水且直径10 cm 的培养皿上，使用培养液洗净鱼卵和杂物，然后用养殖水将受精卵清洗3次，再置于光照培养箱，温度28.5℃，14 h/10 h（光照/黑暗）。

筛选180个受精后2 d 的斑马鱼胚胎，置于12孔培养板中，每孔15个胚胎。通过预实验测出不同给药组的药物浓度，分为空白组、高糖组（130 mmol/L 葡萄糖），阳性药+高糖组和高糖+CaD 30、60、90 μg/mL组。其中阳性药物给予浓度为500 ng/mL VRI 2 mL，CaD 不同浓度组分别给予对应浓度CaD 2 mL，给药时间72 h，每24 小时更换暴露液。在体式显微镜下观测斑马鱼胚胎体节间血管指数。体节间血管指数=完整血管数×1+不完整血管数×0.5，斑马鱼胚胎镜下荧光点数=镜下转基因荧光蛋白Flk1 数量。

将240个于CaD 安全给药浓度范围内筛选的受精后2 d 斑马鱼胚胎置于12 孔板中，每孔20个，评估其最大非致死浓度（MNLD）和最小全致死浓度（MTLD）。

按照TRIZOL 试剂说明书提取总RNA，逆转录具体步骤参照试剂盒说明书。根据PubMed 查询斑马鱼VEGF、NOS、GAPDH 基因序列，使用Primer 6.0 设计引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。PCR过程各检测样本的CT（threshold cycle）值采用2-△△CT方法，对PCR 结果采用统计学软件进行分析。

表1 引物序列及产物长度

收集胚胎，使用蛋白裂解液提取鱼苗蛋白，采用双抗体夹心ELISA法，操作步骤按照ELISA 试剂盒说明书进行。

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据处理与分析，连续型计量资料均符合正态分布，采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

CAD 对高糖诱导斑马鱼体内体节间血管指数的影响见图1（封三）。高糖组斑马鱼胚胎的体节间血管指数及镜下荧光点数显著高于空白组（P＜0.01）。阳性药+高糖组及高糖+CaD 90、60 μg/mL 组斑马鱼胚胎的体节间血管指数及镜下荧光点数低于高糖组（P＜0.05）；高糖+CaD 30 μg/mL 组斑马鱼胚胎的体节间血管指数及镜下荧光点数与高糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。对高糖+CaD 30、60、90 μg/mL 组进行组间比较，发现随着CaD 给药剂量的增加，斑马鱼胚胎体节间血管指数降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与高糖组相比，药物处理后各组斑马鱼胚胎的荧光点数呈下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

 

图1 CaD对高糖诱导斑马鱼体内体节间血管指数的影响（n=12）

表2 CaD对高糖诱导斑马鱼体内体节间血管指数的影响（±s）

 

与高糖组比较，*P＜0.01，#P＜0.05

高糖组的VEGF、NOS 表达明显高于空白组（P＜0.01）；阳性药+高糖组及高糖+CaD 90、60 μg/mL 组VEGF、NOS的mRNA表达水平低于高糖组（P＜0.05）。高 糖+CaD 30 μg/mL 组VEGF、NOS的mRNA表达水平与高糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 CaD对高糖诱导斑马鱼体内VEGF、NOS的mRNA表达水平的影响（±s）

 

与高糖组比较，*P＜0.01，#P＜0.05

高糖组的VEGF、NOS 表达水平明显高于空白组（P＜0.01）。阳性药+高糖组及高糖+CaD 90、60 μg/mL组的VEGF、NOS 蛋白表达水平低于高糖组（P＜0.05）。高糖+CaD 30 μg/mL 组的VEGF、NOS 蛋白表达水平与高糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表4 CaD对高糖诱导斑马鱼体内VEGF、OS 表达水平的影响（pg/mL，±s）

 

与高糖组比较，*P＜0.01，#P＜0.05

本研究参考斑马鱼胚胎毒性试验进行了急性毒性评价[7-8]，选用30、60、90 μg/mL 这3个浓度作为实验浓度。高糖环境能够刺激血管内皮细胞增生[9]、促进毛细血管发育[10]，是糖网[11]、肿瘤浸润[11]的生理基础。本实验利用高糖环境刺激斑马鱼模式生物血管发育[12-13]。VRI 是一种酪氨酸激酶抑制剂，能够显著抑制VEGF，从而引起血管发育受阻[14-15]。因此，本研究利用VRI 作为阳性药物，可抑制血管发育。血管生成是指在原有血管结构的基础上产生新的血管，其中涉及到内皮细胞增殖和迁移、血管腔形成等一系列复杂的生物学过程[16]。VEGF 及VEGF 受体（VEGFR）是血管生成的关键信号分子，两者结合后能够诱导内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）的释放，从而引起血管舒张，使血管通透性增加，达到促血管新生的作用[17]。VEGF是一个家族，包括了VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 和胎盘生长因子（PIGF）[18]。本研究结果显示，在正常转基因斑马鱼中，一定浓度的葡萄糖可显著增加体节间血管指数及镜下荧光点数，提示高糖对正常斑马鱼有促血管生成作用。60、90 μg/mL 的CaD均可不同程度地抑制高糖对血管的发育促进作用，减少体节间血管指数及镜下荧光点数，在基因和蛋白水平能够降低高糖引起的VEGF 和NOS 表达，提示CaD对血管增生性疾病有改善作用。因此，推断CaD可通过下调VEGF 和诱导性一氧化氮合酶，发挥其促血管新生以及修复受损血管的作用。

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Inhibition of angiogenesis in high glucose environment by calcium dobesilate based on zebrafish model and its mechanism study

TANG Zhi-yu DENG Jie-qiang▲ WANG Meng ZUO Ling WU Jin-xia
Department of Pulmonary Diseases,Yongchuan Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chongqing Medical University,Chongqing 402160,China

[Abstract]Objective To observe the inhibitory effect of calcium dobesilate (CaD) on zebrafish embryos angiogenesis and its mechanism.Methods A total of 180 zebrafish embryos were selected and randomly divided into the blank group,the high glucose group (130 mmol/L glucose),the positive drug+high glucose group,the high glucose+CaD(30 μg/mL) group,the high glucose+CaD (60 μg/mL) group,and the high glucose+CaD (90 μg/mL) group.Among them,the high glucose concentration was 130 mmol/L,and the positive drug was 2 mL endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor (VRI) at a concentration of 500 ng/mL.CaD in 2 mL was provided in each CaD group at different concentrations.Three doses of 1/10 maximum non-lethal dose (MNLD,30 μg/mL),1/5 MNLD (60 μg/mL),and 3/10 MNLD (90 μg/mL) were selected as the toxicity indicators with reference to lethality experiment.Drug exposure solution in 2 mL was given for continuous 72 h,which was changed every 24 h.The zebrafish embryonic intersegment blood vessel indexes and the number of fluorescence points were observed and calculated under stereoscopic microscope.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to detect the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and nitric oxide synthase (NOS) in embryos after intervention.The contents of VEGF and NOS were determined by enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA).Results The zebrafish embryonic intersegment blood vessel index,the number of microscopic fluorescence points and the expression levels of VEGF and NOS mRNA in the high glucose group were higher than those in the blank group,and the differences were statistically significant (P＜0.05).The zebrafish embryonic intersegment blood vessel indexes and the number of fluorescence points in the positive drug+high glucose group,the high glucose+CaD (60 μg/mL) group,and the high glucose+CaD (90 μg/mL) group were significantly lower than those in the high glucose group (P＜0.01).The CAD administration groups were compared,the blood vessel indexes of zebrafish embryonic intersegment decreased when the CaD administration dose gradually increased,and the differences were significant (P＜0.05).Compared with the high glucose group,the number of fluorescene points of zebrafish embryos in each group showed a downward trend after drug treatment,and the difference was statistically significant (P＜0.05).The mRNA expression levels of VEGF and NOS in the positive drug+high glucose group,the high glucose+CaD (60 μg/mL)group,and the high glucose+CaD (90 μg/mL) group were lower than those in the high glucose group (P＜0.05).There were no significant differences in the VEGF and NOS mRNA expression between the high glucose+CAD (30 μg/mL)group and high glucose group (P＞0.05).The expression levels of VEGF and NOS in the positive drug+high glucose group,the high glucose+CaD (60 μg/mL) group,and the high glucose+CaD (90 μg/mL) group were lower than those in the high glucose group (P＜0.05).There was no significant difference in the expression of NOS and VEGF between the high glucose+CAD (30 μg/mL) group and high glucose group (P＞0.05).Conclusion CaD can inhibit the angiogenesis of zebrafish embryos in high glucose environment,which is related to the inhibition of VEGF/iNOS.

[Key words]Calcium dobesilate;High glucose;Angiogenesis;Embryotoxicity;Zebrafish

[基金项目]重庆市永川区科技计划项目（自然科学基金）（Ycstc，2016nc5005）

[作者简介]唐志宇，男，医学博士，副主任中医师，硕士研究生导师，主要从事中西医结合肿瘤及呼吸系统疾病临床工作

（收稿日期：2020-05-25）