α-地中海贫血（a-thalassemia），简称α-地贫，是人类最常见的常染色体隐性遗传病之一，曾译为甲型地中海贫血或α-珠蛋白基因生成障碍性贫血，于1955年由Rigas 首先报道，其病因是由于α-珠蛋白基因缺陷，使α-珠蛋白肽链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血[1]。广东省α-地贫发病率达8.53%[2]，珠海市发病率为8.91%[3]。α-地贫分子缺陷主要为α-珠蛋白基因大片段缺失（缺失型，-α），少数为α-珠蛋白基因点突变（非缺失型，αT），最常见的-α 基因有三种，即东南亚缺失（--SEA/）、右侧缺失（-α3.7/）、左侧缺失（-α4.2/）[1]。静止型或轻型α-地贫（缺失1 个或2 个α-基因）表现为无症状携带者；中间型α-地贫（缺失3 个α-基因）的临床表现较为严重，会有轻、中度贫血，黄疸或肝脾肿大等症状[4]；重型α-地贫（4 个α-基因全缺）则可致宫内胎死或胎儿出生前后死亡，甚至导致严重产科并发症[5]。由于目前该病尚无理想的治疗方法，通过产前基因诊断选择性地淘汰中、重型α-地贫胎儿是控制该病发生的首要途径[1]。

根据原广东省卫生厅2006年颁布的《地中海贫血产前诊断技术规范》 要求产前诊断地贫基因需用两种方法进行验证，确保准确性。目前来看，国内大多采用单管多重聚合酶链反应 （single-tube multiplex polymerase chain reaction，gap-PCR） 检测-α 基因，此法成熟、准确率高，在我市也运用了10 余年[6]。本研究主要探讨一种基于实时荧光PCR 的探针熔解曲线法（probe melting curve analysis，PMCA），通过盲法，用其与gap-PCR 同时进行检测-α 基因，并以DNA 测序分析为标准，评估PMCA 检测-α 基因的准确性、适用性，现报道如下。

收集2019年10～12月到珠海市妇幼保健院做α-地贫基因检测的2296 例样本，其中静脉血样本2261 例，羊水样本35 例[孕龄（19.5±1.9）周]，测试前均与受试者签署了知情同意书，并经相关医学伦理委员会批准。

全自动核酸提取仪（厦门致善Lab-Aid824）；荧光PCR 仪（上海宏石SLAN-96S）；扩增仪（珠海黑马Hema9600）；电泳仪（北京六一DYY-8C）；核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统（珠海黑马GSG-2000）。DNA抽提试剂盒、PMCA 试剂盒由厦门致善生物科技有限公司（医疗器械注册证号：国械注准20173403211）提供；gap-PCR 试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司（医疗器械注册证号：国械注准20193401915）提供。

1.3.1 标本处理 静脉血样本均采用乙二胺四乙酸三钾（EDTA-K3）抗凝，羊水标本无须特殊处理。

1.3.2 DNA 抽提和质量鉴定 运用全自动磁珠抽提法。采用Nanodrop R 超微量紫外分光光度计于260、280 nm处测定吸光度 （A） 值以鉴定DNA 纯度和浓度。在A260/A280 比值满足1.60～1.80 的条件下，将待检的DNA 样品用超纯水稀释至20 ng/μl。

1.3.3 -α 基因检测 采取双盲方式，严格按照试剂盒说明书进行操作，PMCA 检测简要过程如下。将预先稀释好的待测DNA 各加5 μl 到含PCR 反应液的A、B 管中，短暂离心后转至荧光PCR 仪进行PCR 扩增和熔解曲线分析。PCR 循环参数为：预先50℃2 min去除扩增产物污染后[尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG 酶）]处理，95℃预变性10 min 后，接着进行2 次PCR 循环。第1 次和第2 次PCR 循环参数分别为：95℃30 s、70℃30 s（每个循环下降1℃）和76℃45 s（10 个循环）和95℃30 s、35℃3 min 和76℃45 s（50 个循环）。扩增完毕后，即进行熔解曲线分析。首先95℃变性1 min、35℃退火3 min，然后以0.4℃/s 的速度从40℃升温至85℃，同时采集荧光5-羧基荧光素（5-carboxyfluorescein，FAM）、5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯（5-carboxyl-x-rhodamine succinimide，ROX）通道信号，从而可得到PCR 产物熔解曲线。对所有标本同时进行gap-PCR 检测。DNA 测序分析由厦门致善生物科技有限公司完成。

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。

严格按照说明书进行结果判读。A 管FAM（A-FAM）通道检测内控基因，B 管FAM（B-FAM）通道检测--SEA/，A 管ROX（A-ROX）通道检测-α3.7/，B 管ROX（BROX） 通道检测-α4.2/，有1 例在B-FAM 通道检测出--SEA/，而在B-ROX 熔解曲线图中可见一峰与野生型峰熔点差（ΔTm）为5.7℃，超出判读范围（4.6±0.5）℃，为一“未知突变”，该例及有代表性的结果见图1（封四）。

 

图1 探针熔解曲线分析（见内文第25 页）

A：内控；B、C、D：缺失型峰所代表依次为--SEA/、-α3.7/、-α4.2/；E、F：1 例--SEA/合并“未知突变”基因

结合2296 例样本αT 基因结果，根据缺失情况进行统计，其中携带有三种常见-α 基因的样本有701例，非携带样本有1595 例。除1 例用gap-PCR 检出--SEA/αα 而用PMCA 检出--SEA/αα 合并一未知突变外，其余检测结果完全一致，两者符合率为99.9%（表1）。

表1 2296 例样本三种常见-α 基因检测的结果（例）

对该例样本进行DNA 测序分析，检测到--SEA/αα 杂合子，同时对PMCA 的B-ROX 探针覆盖的基因区段测序，检测到单个碱基突变，即A＞G（表2），该突变应为熔解曲线图所示的“未知突变峰”。

表2 DNA 测序结果

目前，PMCA 已运用于非缺失型α-地贫及β-地贫的基因诊断，该法快速简便、低成本、准确率高，适用于地贫的大规模筛查及产前基因诊断[7-8]，但运用于缺失型α-地贫基因诊断的临床实验报道极少见。本研究中PMCA 是先运用引物扩增人α-珠蛋白基因和内控基因，再利用荧光标记探针与不同的靶序列杂交形成不同的双链杂交体，在温度由低到高的变化过程中发生解链，同时伴随着荧光探针发出的荧光信号强度的变化，在某一温度荧光强度变化达到最大值即为该双链杂交体的熔点温度（Tm）。不同的双链杂交体其稳定性不同，Tm 值亦不同，从而可呈现出不同的熔解峰以区分不同的靶序列，通过计算不同熔解峰的Tm值与对应野生峰Tm 值之差（ΔTm）来判读结果。本研究发现，PMCA 和gap-PCR 检测方法相比，优势主要有：其一，全程闭管操作，仅需用一台荧光PCR 仪4 h 内就能完成测试，快速简便，而gap-PCR 不仅需多台检测设备占用大量实验室空间，而且扩增完后还需跑凝胶电泳，操作相对繁琐且耗时长，增加开盖污染及人工出错的风险；其二，结果判读直观且客观，gap-PCR则需借助凝胶成像仪人工判读结果，存在一定的主观性；其三，试剂成本低，单个样本成本十几元，gap-PCR 则在六十元左右；此外，PMCA 检测体系中还包含了内控，有效监测了扩增效果，还可提示是否漏加样本。值得一提的是，gap-PCR 采用单管扩增操作，由于a-珠蛋白基因簇中α1 和α2-基因有高同源性及高G+C 特点，当扩增-α3.7/基因片段时重复性欠佳[6]，而PMCA 检测-α3.7/有其特定检测通道，所受影响较少。而且，本研究通过盲法测试，两种方法检测结果基本符合，并且PMCA 能在其检测覆盖区域内准确检出未知突变，说明PMCA 准确率高，与之前报道[7-8]一致，故可作为gap-PCR 的替代或验证方法。此外，近年来有报道[9-10]运用多重连接依赖性探针扩增技术、高通量测序技术诊断α-地贫基因，方法先进且结果精确度高，可以发现罕见类型地贫，甄别母血污染源产前诊断样本，但同时也存在成本高、技术要求高、仪器设备配置高等问题，相比之下，PMCA 更适合普遍推广用于临床和基层实验室。

本研究发现PMCA 也存在一些不足：当DNA 浓度不合适或纯度不高时，容易造成曲线不平滑难以判读；当在探针覆盖区域的基因片段发生了未知基因突变时，可能出现异常峰，从而给判读造成一定困扰；其次目前还仅限于检测三种常见-α 基因。本研究还发现，当判读-α3.7/--SEA 或-α4.2/--SEA 基因型时，由于--SEA/缺失了一对染色体中的一条染色体上全部的α1-和α2-基因，而-α3.7/或-α4.2/缺失发生在另一条染色体上部分的α1 和α2-基因上，即-α3.7/缺失了α1-基因的5′端和α2-基因的3′端，-α4.2/缺失了α2-基因[1]，--SEA/基因片段超出了PMCA 检测体系中A-ROX 或B-ROX 探针检测区域，因此，显示B-FAM曲线图上有--SEA/缺失型峰和野生型峰，而在AROX 或B-ROX 曲线图上仅有-α3.7/或-α4.2/缺失型峰，无野生型峰，这需要特别注意，不要遗漏而错判为-α3.7/或-α4.2/纯合子，最好结合αT 基因型、β-地贫基因型及血液学表型综合分析，以提高准确性。另外，本研究中PMCA 检测到1 例--SEA/αα 合并未知突变基因，经DNA 测序确认的单碱基突变，可能由于SNP多态性所致，同时结合该例临床表现来看，有明显的小细胞低色素性贫血，未见异常血红蛋白带，综合分析其确与--SEA/αα 基因型相当，也与gap-PCR 检测结果一致。

近年来，地贫因其具有致死性、致残性、可导致出生死亡或缺陷而引起国内外广泛关注[11]，全球每年约有70 000 例地贫患儿出生[12]，国内外治疗地贫的方法有限，长期输血治疗，造成严重的家庭、社会经济负担，甚至严重的精神负担[13-14]。作为高发地区的珠海市，2013年已将地中海贫血基因检测列为孕前产前免费项目，结婚夫妇双方先进行孕前及产前的筛查，必要时做产前基因诊断，从而降低中、重型地贫患儿的出生率。目前本实验室已建立应用RDB 联合PMCA 对非缺失型α-地贫及β-地贫进行产前基因诊断的双重体系，大大提高了准确率同时还防止漏诊及误诊[15]，本研究中经PMCA 检测35 例羊水样本与gap-PCR 结果完全吻合，且结果准确，其还可对可能存在少量母体污染源的羊水样本具有更明显的提示作用[15]，所以PMCA 可作为另一种验证方法进行缺失型α-地贫的产前基因诊断，也可以尝试展开应用gap-PCR 联合PMCA 对缺失型α-地贫的产前基因诊断。

对于下一代测序技术高速发展的今天，对α 珠蛋白基因直接进行序列分析的检测方法也是可行的，但综合成本效益及本实验室规模考虑，目前更倾向于选择一种快速、准确、简便、高效的方法，因为经过血液学表型筛选后的每个孕前产前育龄人群都需做α-地贫基因检测[16]，而PMCA 具备对大样本量筛查的优势，可先用PMCA 对α-地贫基因进行快速筛查，如发现基因型与表型不符，再用gap-PCR 及RDB 复检或有必要时做DNA 测序，从而尽早得出准确结果，临床也能及时进行孕前产前指导。

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Application of fluorescence PCR-probe melting curve analysis in the rapid diagnosis of deletion α-thalassemia

LI Lian-xiang XIAO Qi-zhi ZHANG Su-fen WU Hong-qiu
Department of Clinical Laboratory, Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital, Guangdong Province,Zhuhai 519001, China

[Abstract]Objective To explore the application of fluorescence PCR-probe melting curve analysis (PMCA) in the rapid diagnosis of deletion α-thalassemia. Methods A total of 2261 blood samples and 35 amniotic fluid samples were collected in Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital from October to December 2019.Through double-blind method, PMCA and single-tube multiplex PCR (gap-PCR) were used to detect three common deletion αthalassemia genes in these 2296 clinical samples.The samples inconsistent with results were confirmed by DNA sequencing analysis. Results In these 2296 samples, except for one unknown mutation gene detected by PMCA in one sample, the results of PMCA in others were consistent with those of gap-PCR, with a coincidence rate of 99.9%.DNA sequencing of the only inconsistent sample showed that a single base mutation (A＞G) occurred in the probe coverage area. Conclusion PMCA can quickly and accurately detect three common deletion α-thalassemia genes, which can be used as an alternative or verification method of gap-PCR technology, as well as for large-scale population screening and prenatal diagnosis.

[Key words] Probe; Melting curve; α-thalassaemia; Multiplex polymerase chain reaction

[中图分类号] R714.55

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-4721（2020）5（c）-0024-04

[作者简介] 李恋湘（1982-），女，广东珠海人，本科，主管技师，主要从事分子遗传研究

（收稿日期：2020-02-25 本文编辑：任秀兰）