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目前酚氨咖敏颗粒的国家药品标准[1]采用高效液相色谱法，用2种色谱条件对氨基比林、咖啡因及马来酸氯苯那敏等三个组分的含量进行测定，未收载对乙酰氨基酚的含量控制方法。且该品种为口服固体制剂，溶出度是制剂评价的重点项目，体外溶出度试验是评价口服固体制剂内在质量的一种重要方法[2]，尤其是多种pH 溶出介质中的溶出行为，不仅可反映仿制制剂内在品质是否一致，还可提高药物生物等效性试验的成功率[3-7]。建立有区分力的溶出曲线可以在一定程度上比较不同制剂的差别，评价药品的质量[8-9]。故本研究根据国家颁布的相关指导原则规定，建立四组分的含量测定方法及溶出曲线测定方法，探索酚氨咖敏颗粒中四种有效成分的溶出情况，为仿制制剂的生产工艺和内在质量提升研究提供参考及思路[10]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪（美国Waters）；Wa ters 2998 PDA 二极管阵列检测器（美国Waters）；Waters XTERRA MS C18（4.6×250 mm，5 μm）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦）；Agilent DAD 二极管阵列检测器（美国安捷伦）；Agilet ZORBAX XDB C18（4.6×250 mm，5 μm）。

1.2 试药

酚氨咖敏颗粒（H5321827，批号190701、190702、190703）；对乙酰氨基酚对照品（100018-20161，中国食品药品检定研究院）；氨基比林对照品（10053-201302，中国食品药品检定研究院）；咖啡因对照品（171215-201512，中国食品药品检定研究院）；马来酸氯苯那敏对照品（100047-201507，中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 氨基比林、对乙酰氨基酚及咖啡因检测的色谱条件

色谱柱为Waters XTERRA MS C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-水（35∶5∶60）；流速为1.0 ml/min；检测波长为273 nm。

2.1.2 马来酸氯苯那敏检测的色谱条件

色谱柱为Agilet ZORBAX XDB C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.3%十二烷基磺酸钠溶液-磷酸=60∶40∶0.02（用三乙胺调pH 到3.3）；流速为1.0 ml/min；检测波长为215 nm。

2.2 方法学验证

2.2.1 氨基比林、对乙酰氨基酚及咖啡因含量方法学验证

2.2.1.1 专属性取流动相作为空白对照溶液；按处方比例称取各辅料，加流动相溶解，制成空白辅料溶液；酚氨咖敏颗粒研细，取细粉300.17 mg（约相当于氨基比林10 mg），加入流动相25 ml，称定重量，超声处理30 min，放置至室温，用流动相补足重量，滤过，精密量取续滤液5 ml，置50 ml 量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，过0.45 μm 滤膜，作为供试品溶液。

取上述各溶液10 μl，采用高效液相色谱法检测，结果见图1～3，提示该方法专属性良好。

图1 空白溶剂

图2 空白辅料

图3 供试品

a：对乙酰氨基酚；b：咖啡因；c：氨基比林

2.2.1.2 精密度精密移取三种对照品溶液各5 ml，置于50 ml 量瓶中，加流动相定容至刻度，得混标溶液。取混标溶液10 μl，重复进样6次，计算峰面积的RSD值。结果提示，对乙酰氨基酚峰面积的RSD 为0.31%，咖啡因峰面积的RSD 为0.48%，氨基比林峰面积的RSD 为0.49%，符合验证要求（RSD≤1.0%），提示该方法精密度良好。

2.2.1.3 重复性平行制备6份供试品溶液，各进样10 μl，计算各成份峰面积RSD值。结果提示，对乙酰氨基酚峰面积的RSD 为1.51%，咖啡因峰面积RSD 为1.51%，氨基比林峰面积的RSD 为1.51%，重复性符合验证要求（RSD≤2.0%）。

2.2.1.4 线性精密称取对乙酰氨基酚对照品60.45 mg、咖啡因对照品12.51 mg和氨基比林对照品40.28 mg，置于100 ml 量瓶中，加流动相溶解定容至刻度，作为混标储备液。分别精密量取混标储备液0.5、1、2、5、6、8 ml 于50 ml 量瓶中，加流动相定容至刻度，各进样10 μl，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制线性关系图，结果见图4～6。结果提示，对乙酰氨基酚浓度在6.04～96.72 μg/ml 内，咖啡因浓度在1.25～20.02 μg/ml 内，氨基比林浓度在4.03～64.45 μg/ml内，线性符合验证要求（r≥0.998）。

图4 对乙酰氨基酚线性关系图

图5 咖啡因线性关系图

图6 氨基比林线性图

2.2.1.5 回收率分别精密量取混标储备液4、5、6 ml于50 ml 容量瓶中，各加入空白辅料溶液5 ml，最后加流动相定容至刻度。平行制备3份，各进样10 μl，计算9份样品回收率的RSD，结果见表1，结果提示，该方法回收率良好。

2.2 马来酸氯苯那敏含量测定方法学验证

2.2.1 专属性取酚氨咖敏颗粒约1 g 于三角瓶中，加50 ml 流动相后称重，超声处理10 min，放置至室温，称重，用流动相补足损失，过0.22 μm 滤膜，取续滤液，进样20 μl，记录色谱图（图7），结果提示，方法专属性良好。

表1 回收率结果

图7 供试品溶液

2.2.2 精密度

取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积。结果显示，峰面积RSD 为0.32%，提示该方法精密度良好。

2.2.3 重复性

平行制备6份供试品溶液，各进样10 μl，记录峰面积。结果显示，峰面积的RSD 为0.75%，提示该方法的重复性良好。

2.2.4 线性

精密称取马来酸氯苯那敏对照品适量，加流动相制成浓度约为0.21 mg/ml的线性储备溶液。取线性储备液，逐级稀释制成浓度为21.24、8.50、4.25、2.12和0.85 μg/ml的线性溶液。

取上述线性储备液和线性溶液，各进样10 μl，记录峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制线性关系图，结果见图8，提示马来酸氯苯那敏在浓度0.85～21.24 μg/ml 内，线性关系良好。

图8 马来酸氯苯那敏线性关系图

2.2.5 回收率

按处方比例加入各辅料，配制成空白辅料储备液。精密称取马来酸氯苯那敏对照品适量，加流动相制成浓度为0.1951 mg/ml的马来酸氯苯那敏对照品溶液；分别取马来酸氯苯那敏对照品溶液0.8、1.0及1.2 ml 各3份于10 ml 量瓶中，然后分别加入空白辅料储备液各5 ml，用流动相定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液进样检测，记录峰面积，计算回收率，结果见表2，提示该方法回收率良好。

表2 回收率检测结果

2.3 四种主成分溶出研究

2.3.1 试验条件

根据2015年版《中国药典》[11]及《普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》分别配制溶出介质。介质体积为900 ml，37℃采用桨法，转速50 r/min，每次取样10 ml 后补充相应的介质10 ml，取样时间为5、10、15、20、30、45及60 min。样品经0.45 μm 滤膜过滤后，采用高效液相色谱法检测，按照公式计算累积溶出度。

2.3.2 溶出结果

2.3.2.1 酚氨咖敏颗粒中对乙酰氨基酚在四种介质中的溶出情况酚氨咖敏颗粒中对乙酰氨基酚在四种介质中的溶出曲线见图9～12。

图9 0.1N 盐酸介质中的溶出

图10 水介质中的溶出

图11 pH4.0 介质中的溶出

图12 pH6.8 介质中的溶出

2.3.2.2 酚氨咖敏颗粒中氨基比林在四种介质中的溶出情况酚氨咖敏颗粒中氨基比林在四种介质中的溶出曲线见图13～16。

图13 0.1N 盐酸介质中的溶出

图14 水介质中的溶出

图16 pH6.8 介质中的溶出

2.3.2.3 酚氨咖敏颗粒中咖啡因在四种介质中的溶出情况酚氨咖敏颗粒中咖啡因在四种介质中的溶出曲线见图17～20。

图17 0.1N 盐酸介质中的溶出

图18 水介质中的溶出

图19 pH4.0 介质中的溶出

图20 pH6.8 介质中的溶出

2.3.2.4 酚氨咖敏颗粒中马来酸氯苯那敏在四种介质中的溶出情况酚氨咖敏颗粒中马来酸氯苯那敏在四种介质中的溶出曲线见图21～24。

图21 0.1N 盐酸介质中的溶出

图22 水介质中的溶出

图23 pH4.0 介质中的溶出

图24 pH6.8 介质中的溶出

结果提示，酚氨咖敏颗粒中四种有效成分在四种溶出介质中60 min 内均能达到85%以上。

3 讨论

目前颗粒剂的质量标准中仅要求测定溶化性，经对比研究发现，溶化性的结果并不能反映制剂内在质量的差异。指导原则中提到篮法和桨法是目前最常用的溶出测定方法，一般首选桨法[3]，且不宜采用高于50 r/min的转速，否则会极大地弱化不同处方或制剂间溶出行为的差异。

溶出行为测定是目前美国、日本及我国对药品质量进行评价的一种常用方法[7，12]，制剂体外溶出行为是否一致是评价制剂质量差异及开展生物等效性（BE）试验的必要参考[13]。

溶出试验的样品一般采用紫外（UV）法测定，但本品中四种有效成分含量差别较大，且采用UV 测定时，辅料的干扰会使测得的溶出度值偏高，同时由于其他各厂家生产的制剂的无法获得，故辅料对测定结果的干扰无法评价，而绝大多数辅料皆属惰性，在反向色谱柱上不会出峰，即便出峰保留时间也很短[14]，不会干扰主成分的测定，因此采用高效液相色谱法测定专属性更强，结果更准确[15]。

在临床研究成本不断攀升的背景下，采用有区分力的溶出曲线来剖析仿制制剂的内在质量，是提高BE 试验通过率最有效和最经济的手段[16]。溶出度检查方法的区分力是指方法可发现和区分制剂质量变化的能力[17]。有区分力的溶出度检查方法可用于评估仿制药处方工艺、获得原研药品关键特征以及提高BE 试验的成功率等[18-19]。仿制制剂与参比制剂的多条有区分力的溶出曲线相似，更客观地反映制剂的一致性，两者体内生物利用度一致的概率达到90%[20]。

目前国内正在开展药物制剂的质量与疗效一致性评价，利用有区分力的溶出曲线来剖析口服固体制剂的内在质量，无疑是提高生物等效性试验的最有利和最经济的手段[4]。一般认为，找到45～60 min 释放达到85%的溶出介质，或90～120 min 达85%的溶出介质且溶出曲线无拐点和突释，这样的曲线被认为最具区分力[11]。

[参考文献]

[1]Materia Medica Standards of State Drug Administration（国家药品监督管理局国家药品标准）[S].WS-10001-（HD-1108）-2002.

[2]陈承贵，李美芳，庞根发，等.国产地氯雷他定片的溶出曲线考察[J].中国药业，2019，28（1）：24-27.

[3]谢沐风.如何科学、客观地制定溶出度试验质量标准[J].中国医药工业杂志，2012，43（3）：243-252.

[4]谢沐风.改善溶出度评价方法，提高固体药物制剂水平[J].中国医药工业杂志，2005，36（7）：447-451.

[5]王诗红，黄斌，张辉煌，等.多条溶出曲线评价盐酸二甲双胍片的溶出行为[J].药学与临床研究，2016，24（1）：26-28.

[6]贾文君，全立卿.盐酸西替利嗪片仿制药与原研药的溶出度一致性评价[J].中国药物评价，2017，34（6）：410-413.

[7]张启明，谢沐风，宁保明，等.采用多条溶出曲线评价口服固体制剂的内在质量[J].中国医药工业杂志，2009，40（12）：946-950，955.

[8]国家食品药品监督管理总局.普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则[EB/OL].[20160318].http：//samr.cfda.gov.cn/WS01/CL0087/147583.html.

[9]米楠，马超，房思萌，等.依潘立酮片溶出度一致性评价研究[J].药物评价研究，2017，40（2）：164-168.

[10]胡昌勤，潘瑞雪.溶出度试验评价/预测固体口服制剂生物等效性的研究进展[J].中国新药杂志，2014，23（1）：44-51.

[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版二部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：244-258.

[12]程莹莹，陈振阳，曾环想，等.硫酸氢氯吡格雷片体外溶出曲线相似性评价[J].中国新药杂志，2018，27（4）：471-476.

[13]国家食品药品监督管理总局.总局关于发布《人体生物等效性实验豁免指导原则》的通告（2016年第87号）：人体生物等效性实验豁免指导原[EB/OL].（2016-05-19）[2019-01-14].http：//www.sfda.gov.cn/WSO1/CL0087/153483.html.

[14]谢沐风.高效、准确、快捷地测定大批量溶出度样品[J].中国医药工业杂志，2010，41（7）：548-549.

[15]龚海虹.药物溶出度试验的应用概述[J].海峡药学，2008，20（11）：123-125.

[16]彭国维，高春花，宋珊珊，等.采用有区分力的溶出曲线评价难溶性头孢菌素类仿制制剂的质量[J].广东药科大学学报，2018，34（1）：15-20.

[17]王亚敏.浅谈溶出度检查方法的分辨力[J].药物分析杂志，2012，32（11）：2094-2096.

[18]关玉晶，姜建华.具有区分力的罗红霉素片体外溶出度方法研究[J].药物评价研究，2017，40（12）：1727-1730.

[19]谢沐风.具有区分力的溶出曲线[J].中国医药工业杂志，2014，45（7）：687-689，705.

[20]谢沐风.解读“口服固体制剂仿制药一致性评价技术手段——多条溶出曲线”[J].中国医药工业杂志，2013，44（4）：411-414.