糖尿病是临床的常见病和多发病，具有较高的发病率，好发于中老年群体中，占到了总数的90%以上[1]。近年来，受到人口老龄化加剧的影响，糖尿病的发病率明显上升，临床防治形势不容乐观。糖尿病的病程长、进展慢，但若未及时得到有效治疗，会引发相应的并发症。在糖尿病早期，糖尿病主要引起微血管病变，是指由于毛细血管基底膜增厚导致的毛细血管以及毛细血管前小动脉病变心肌微血管病变和心肌代谢紊乱引起心肌广泛缺血、灶性坏死纤维化，这是糖尿病慢性心肌缺血损伤的病理生理特点[2]。同时，糖尿病可以加速动脉粥样硬化的发展，激活基质金属蛋白酶（MMP），破坏冠脉斑块稳定性，导致冠脉急性闭塞，这是糖尿病急性心肌缺血损伤的病理生理特点[3-4]。本研究中为了进一步了解Toll 样受体3（TLR3）基因突变rs3775291 点突变在糖尿病急慢性心肌缺血中的损伤作用及其机制，选取由南昌大学实验动物中心提供80只基因敲除SD 大鼠作为研究对象展开分析，现报道如下。

选取2019年1?4月由南昌大学实验动物中心提供80只基因敲除SD 大鼠作为研究对象。本研究已经通过南昌大学医学院动物伦理委员会审查。SD 大鼠均体重为250?300 g，2?3月龄，置于清洁级（SPF）动物实验室饲养，每笼5只，自由进食、饮水，室内温度20?25℃，相对湿度40%?70%，在光/暗周期为12 h/12 h的条件下饲养。

制作大鼠缺血/再灌注模型，实验前禁食12 h，3.5 ml/kg的10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，生产批号H37022673）麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定，气管插管，接人工呼吸机（呼吸频率：70 次/min，潮气量：20 ml）。开胸结扎冠脉左前降支，胸骨左侧2 mm切开皮肤，钝性分离肌肉见肋骨，在三四肋间，用拉钩拉开胸壁，小心剪开心包膜，在左心耳下缘3?4 mm进针，进针深约1.5 mm，斜向右上方肺动脉圆锥方向进针，针距3?4 mm。稳定1 min 后，收紧结扎线，30 min后轻拉松结线，扩开血管再灌注，缝合。

采用随机数字表法，将80只缺血/再灌注模型SD 大鼠分为野生型组（40只）和突变型组（40只）。野生型组大鼠仅丝线穿过冠状动脉，但左室支不结扎，通过尾静脉注射生理盐水。突变型组大鼠选取TLR3基因敲除大鼠制作模型。

比较两组大鼠的TLR3和核因子κB（NF-κB）蛋白表达、血清趋化因子（IP-10）、白细胞介素-8（IL-8）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性指标水平。

（1）Western blot 法检测TLR3、NF-κB蛋白表达，制模结束后处死手术处理后的存活大鼠，按试剂盒说明书步骤提取总蛋白，碾磨心肌组织，BCA 蛋白定量法进行蛋白定量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品后转膜，常温下洗膜缓冲液（TBST）封闭过夜，加入一抗后室温下免疫沉淀1 h，再加入兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗2 h，显影，定影，扫描。

（2）测定两组各项炎症指标，包括IP-10、IL-8 与TNF-α。清晨空腹状态下，抽取3 ml 大鼠静脉血，离心处理，取上层清液送检，采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测。

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

突变型组的TLR3、NF-κB蛋白表达均高于野生型组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 两组TLR3、NF-κB蛋白表达水平的比较（±s）

两组的IP-10、IL-8、TNF-α 水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

表2 两组IP-10、IL-8 与TNF-α 水平的比较（±s）

糖尿病心脏病是糖尿病患者致死的主要原因之一，糖尿病心脏病患者与非糖尿病患者比较，常常起病更早，病情隐匿不宜发现[5]。糖尿病患者伴心肌损伤，常表现为无痛性心肌梗死，梗死面积大，穿壁梗死多，病情严重，预后差，病死率高[6]。TLR3 在糖尿病及冠心病中均起到了重要作用，然而TLR3 基因rs3775291位点的突变在糖尿病心肌的损伤作用和具体机制尚未阐明[7]。不少研究表明，动脉粥样斑块的形成和斑块的不稳定，以及胰岛细胞的凋亡均与Toll 样受体（TLR）有关[8]。TLR是一类重要的天然自身免疫因子，迄今已在哺乳类动物中发现十余种TLR，称为TLR 受体家族[9]。

TLR 蛋白作为单个的跨膜非催化性蛋白质，具有保守的分子结构。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，TLR 可以识别它们，并激活机体产生免疫细胞应答[10]。大部分TLRs是通过髓样分化因子（MyD88）信号途径激活不同的细胞因子和化学激活因子，从而在病变的演变中发挥作用[11]。TLR3 与TLRs 家族中的其他成员有所不同，TLR3 主要通过TRIF 信号途径（MyD88 非依赖的信号传导途径）起到作用[12]。在TLR3的研究中显示，野生型TLR3 基因可以减少三酰甘油的合成，加快体内脂质的清除，提升血清高密度脂蛋白（HDL）水平，维持体内血糖稳态，对动脉血管内皮起到一定的保护作用；而TLR 基因突变可导致胰岛β 细胞分泌减少，糖和脂质代谢紊乱，内皮功能失调，引起细胞凋亡[13]。

人TLR3 基因定位于4q35，由17 570个核苷酸组成，编码由904个氨基酸组成的蛋白质，其独特的结构是其胞内结构域中不含有其他TLR 中保守的脯氨酸，而是由丙氨酸替代，这种替代在人和小鼠中是保守的[14]。在TLR3 基因中，rs3775291位于第4 外显子上，rs3775291 发生突变时，等位基因G/C 突变为A/T，所编码的亮氨酸（Leu）被错译为苯丙氨酸（Phe）[15]。本研究结果提示，突变型组的TLR3、NF-κB蛋白表达均高于野生型组，差异有统计学意义（P<0.05），两组的IP-10、IL-8、TNF-α 水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示TLR3 基因rs3775291位点突变，会造成糖尿病急慢性心肌缺血损伤，通过TLR3、NF-κB蛋白表达和炎症反应表达的作用机制，促使病情进展。

综上所述，TLR3 基因rs3775291位点突变是糖尿病急慢性心肌缺血损伤的作用机制，会加重患者病情，需加强防治。

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Injury mechanism study of rs3775291 mutation of Toll-like receptor 3 gene in acute and chronic myocardial ischemia of diabetes mellitus rats

SHAO Liang1 ZHANG Ping2 CAI Xin-yong1 XIAO Bin1 MEI Song-bei1
1.Department of Cardiology,Jiangxi Provincial People′s Hospital,Nanchang 330000,China;2.Department of Neurology,Jiangxi Provincial People′s Hospital,Nanchang 330000,China

[Abstract] Objective To explore the injury mechanism of Toll-like receptor 3 (TLR3) gene rs3775291 mutation in acute and chronic myocardial ischemia of diabetes mellitus rats.Methods Eighty gene knockout SD rats were selected as the research objects from the Experimental Animal Center of Nanchang University from January to April 2019.They were divided into wild-type group (n=40) and mutant type group (n=40) by random number table method.The rats in the wild-type group were only silk thread passed through coronary artery but left ventricular branch was not ligated,and normal saline was injected through tail vein.In the mutant type group,TLR3 gene knockout rats were selected to make the model.The TLR3,nuclear factor κB (NF-κB) protein expressions,chemokine 10 (IP-10),interleukin 8 (IL-8),and tumor necrosis factor α (TNF-α) levels were compared between the two groups.Results The TLR3 and NF-κB protein expressions in the mutant type group were higher than those in the wild-type group,with statistically significant differences (P<0.05).There were no significant differences in the levels of IP-10,IL-8 and TNF-α between the two groups (P>0.05).Conclusion In the diabetes mellitus rat model of acute and chronic myocardial ischemia,the expression levels of TLR3 gene and protein were significantly increased,and the levels of inflammatory indicators were also increased.The mutation of TLR3 gene rs3775291 site is closely related to the injury mechanism.

[Key words] Toll-like receptor 3;Mutation of gene locus;Acute and chronic myocardial ischemia of diabetes mellitus;Injury mechanism

[中图分类号]R392.1

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2020）1（b）-0009-03

[基金项目]江西省卫生计生委科技计划项目（20195009）

（收稿日期：2019-05-07 本文编辑：孟庆卿）