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肺纤维化是临床上常见肺部疾病，它是由多种因素引起的慢性进行性纤维化肺炎，组织学上表现为间质性肺炎，该类疾病的病理特点表现为炎症反应、成纤维细胞增殖以及细胞外基质蛋白沉积[1]，其发病率正逐年增高，病死率较高。

肺纤维化治疗一直是医学界的难题，吡非尼酮和尼达尼布是临床常用的治疗药物，2014年10月，美国食品和药物管理局批准该2 种药物用于治疗特发性肺纤维化[2]。吡非尼酮具有抗纤维化、抗炎和抗氧化作用，体内、外实验显示，吡非尼酮能通过抑制致纤维化因子，如血小板衍化生长因子（PDGF）和成纤维细胞生长因子（bFGF）等的过度表达，从而减少成纤维细胞的增殖和胶原的合成和积累，抑制细胞外基质的沉积[3-5]。尼达尼布是新一代治疗特发性肺纤维化药物，主要抑制致纤维化因子受体，如血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血小板衍化生长因子受体（PDGFR）与纤维母细胞生长因子受体（FGFR）等，进而抑制纤维化进程[6-9]，且临床使用相对安全。

吡非尼酮和尼达尼布在临床上常单独使用，治疗机制分别通过细胞因子和细胞因子受体起作用，两者联合使用还未有研究，联合治疗的效果和方法还未知，本项目试用该两种药物联合治疗动物肺纤维化，初步探索其治疗效果和治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取昆明小鼠，雄性90 只，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证编号：SCXK（鲁）20140007，鼠龄为6～8 周，体重（35±2）g，常规饲养于无特定病原体环境。动物实验研究遵循国家制定的有关实验动物保护和使用的指南，并经泰山医学院实验动物伦理委员会批准（批准号：2016040）。

1.2 主要试剂和仪器

吡非尼酮购自北京康蒂尼药业有限公司（批号H20133376）和尼达尼布购自杭州民生药物研究院（批号MS20140301）；博来霉素购自日本化药株式会社（批号20100512）；戊巴比妥钠购自中国医药（集团）上海化学试剂公司（批号F20020915）；瑞士染液、吉姆萨染色和生理盐水等常规试剂购自泰安普天科技有限公司。

Buxco 小动物肺功能分析系统由美国BUXCO 公司生产，型号为PFT；倒置显微镜由日本尼康公司生产，型号为TS100。

1.3 实验方法

1.3.1 造模把小鼠适应性饲养1 周，随机抽取10 只作为对照组，其余80 只作为模型组。用3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，切开颈部皮肤，模型组用注射器穿刺气管注入2 mg/kg 的博来霉素，然后缝合皮肤。对照组同法注入生理盐水。采用Buxco 动物肺功能分析系统测定小鼠的肺功能，记录Penh 值。

1.3.2 分组把制备的肺纤维化小鼠模型常规饲养，用Buxco 动物肺功能分析系统测定小鼠的肺功能，Penh值上升至1.50 以上显示造模成功，从造模成功的小鼠中随机抽取40 只，随机分成4 组，每组10 只，分别为对照组、吡非尼酮组、尼达尼布组、吡非尼酮和尼达尼布组（分别编号为1、2、3、4 组）。

1.3.3 给药 1、2、3、4 组分别灌胃生理盐水（0.1 ml 生理盐水，每天3 次）、吡非尼酮（400 mg/kg，每天3 次）、尼达尼布（150 mg/kg，每天2 次），吡非尼酮（400 mg/kg，每天3 次）和尼达尼布（150 mg/kg，每天2 次），连续用药3 周。每天观察小鼠、称重等。采用上法测定肺功能，记录Penh 值。麻醉后处死小鼠，结扎左肺，灌洗右肺肺泡，收集肺泡灌洗液，取上清液，离心后，取沉淀，涂片，晾干后进行瑞士-吉姆萨染色，先用瑞士染液染色4 min，水洗，吉姆萨染液染色2 min，水洗，倒置显微镜下计数白细胞总数。

1.4 观察指标及评价标准

造模后观察小鼠的精神状态、反应快慢、进食、大小便、体重等。以肺功能Penh 值作为造模成功与否的指标，以肺功能Penh 值和白细胞数作为治疗效果评价的指标。

1.5 统计学方法

运用SPSS 17.0 软件分析数据，计量资料用

±s表示，采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺功能Penh 值的比较

建模7 d 后，对照组小鼠精神状态良好，反应机敏，进食饮水正常，大小便正常；实验组小鼠精神状态较差，反应慢，进食和饮水减少。建模21 d，模型组小鼠体重（37.13 g）小于对照组（39.62 g）（P＜0.05）。3 周后，对照组的肺功能Penh 值为0.48，模型组的肺功能Penh 值上升至1.82。模型组肺功能的Penh 值大于对照组（P＜0.05）。80 只小鼠造模成功50 只，造模率为62.5%。

从50 只造模成功的小鼠中随机筛选40 只，随机分为4 组。经过3 周治疗后，对照组的肺功能Penh 值为1.68，吡非尼酮组降低至1.21、尼达尼布组降低至1.32，吡非尼酮和尼达尼布组的肺功能Penh 值降低至0.49。吡非尼酮和尼达尼布联合治疗组肺功能Penh 值显著小于吡非尼酮组（P＜0.05）、尼达尼布组（P＜0.05）和对照组（P＜0.01）。吡非尼酮组和尼达尼布组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组小鼠肺泡灌洗液中白细胞计数的比较

从50 只造模成功的小鼠中随机筛选40 只，随机分为4 组。经过3 周治疗后，对照组的肺泡灌洗液白细胞计数为5.82×105/ml，吡非尼酮组3.11×105/ml、尼达尼布组3.43×105/ml，吡非尼酮和尼达尼布组2.71×105/ml。其中联合治疗组的白细胞计数少于对照组（P＜0.01）、吡非尼酮组（P＜0.05）和尼达尼布组（P＜0.05），吡非尼酮组和尼达尼布组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

肺纤维化是一种慢性炎症性间质性疾病，以肺间质弥漫性渗出、浸润和纤维化为主要病变，肺纤维化的5年生存率为30%～50%，是一种严重危害人类健康的重大疾病。导致肺纤维化的原因很多，常见的诱发因素包括药物、吸烟、粉尘、空气污染、病毒感染、胃食管返流以及遗传因素等，一些风湿免疫性疾病也可伴发肺纤维化[10]。目前现代医学对于肺纤维化缺乏特效治疗手段，多采用的药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂和抗纤维化制剂，但疗效不佳且毒副作用明显[11-12]。目前治疗研究的焦点也开始从抗炎向抗纤维化转变，一些抗纤维化的药物，如吡啡尼酮、尼达尼布等已显现出较为理想的治疗前景[13-15]。

由于药物的副作用等因素，利用动物模型研究是主要的方法之一。目前肺纤维化的动物模型有小鼠、大鼠等。小鼠具有个体小、易操作等特点是常用制备肺纤维化的理想模型。博莱霉素是常用抗生素，也是广谱性抗肿瘤药，其对多种肿瘤有效。但使用过程中的副作用之一是引起肺纤维化。博来霉素能够在较短的时间内诱导实验动物肺纤维化，所以是用来制备肺纤维动物模型常用的药物[16-18]。因此本实验将其注入小鼠气管制备肺纤维化模型，从肺功能Penh 值上升可看出成功制备了小鼠肺纤维化模型。

目前肺纤维化缺乏特效药。常用的药物包括伊马替尼、安倍生坦、强的松、硫唑嘌呤等，虽然有一定的效果，但副作用大。吡非尼酮和尼达尼布是临床上近几年使用的新药，一般单独使用进行治疗，本实验采用吡非尼酮联合尼达尼布治疗小鼠肺纤维化，从肺功能Penh 值和白细胞数下降看出治疗效果优于单独使用。本实验在动物水平发现了吡非尼酮和尼达尼布联合治疗肺纤维化有很好的治疗效果，在临床上对肺纤维化患者联合使用是否也具有同样的效果，有待于在临床进一步研究，联合使用对机体的副作用也有待于进一步探索。

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The effect of Pirfenidone combined with Nintedanib treating pulmonary fibrosis in mice

WANG Xue1 LI Qiao-ling2 GAO Yun-yun2 DENG Wen2▲
1. Clinical Medical College, Taishan Medical University, Shandong Province, Tai′an 271000, China； 2. College of Basic Medical Sciences, Taishan Medical University, Shandong Province, Tai′an 271000, China

[Abstract] Objective To explore the effect and method of Pirfenidone combined with Nintedanib treating pulmonary fibrosis in mice. Methods All of 90 male Kunming mice aged 6-8 weeks were selected, After 1 week of adaptive feeding, and among them, 10 mice were randomly selected as control group, and the other 80 mice were treated with Bleomycin to establish pulmonary fibrosis model. The pulmonary function of the mice was measured by Buxco animal pulmonary function analysis system. The Penh value increased to more than 1.5, and the model was established successfully. 40 model mice were selected randomly from successful mice modeling and randomly divided into control group (0.1 ml normal saline, 3 times a day), Pirfenidone group (400 mg/kg, 3 times a day), Nintedanib group (150 mg/kg,2 times a day), Pirfenidone (400 mg/kg, 3 times a day) combined with Nintedanib group (150 mg/kg, 2 times a day).The mice were gavaged for 3 weeks. Penh value was measured using the above-mentioned method. Then the mice were sacrificed after anaesthetized. The alveolar lavage fluid was collected and centrifuged, then the cells were obtained. After Swiss-Giemsa staining, the white cells in alveolar lavage fluid of mice were counted under inverted microscope.Results A total of 80 mice were modeled and 50 mice (62.5%) were successfully modeled. After treatment, the Penh value in Pirfenidone group combined with Nintedanib group were lower than those in Pirfenidone group (P＜0.05),Nintedanib group (P＜0.05) and control group (P＜0.01). The leukocyte of Pirfenidone combined with Nintedanib group was fewer than that of Pirfenidone group (P＜0.05), Nintedanib group (P＜0.05) and control group (P＜0.01). Conclusion The therapeutic effect of Pirfenidone combined with Nintedanib is the best, which lays a foundation for the clinical use of this method in the treatment of pulmonary fibrosis.

[Key words] Pirfenidone； Nintedanib； Combined treatment； Idiopathic pulmonary ifbrosis