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石榴皮在我国传统医学中为一味常见中药，是石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮。诸多研究表明，其果皮、种子、果汁、叶、花等均含有各种对人体有益的营养成分，具有一定的保健和药用价值［1-6］。石榴皮中多酚类、黄酮类、有机酸类和生物碱类等物质含量均较高［7-8］，其中石榴皮多酚则是多羟基酚类物质的总称。现代药理研究证明，石榴皮多酚有清除自由基、抗突变、抑菌、抗癌、抗病毒、消炎以及保护心血管系统等功能［9-10］。因此，石榴皮多酚在食品、医药、日用化学品等领域有很好的应用价值。本研究中所用石榴皮均来自云南蒙自产，利用对Folin-Ciocalteu比色法测量石榴皮含量的各种因素进行系统研究与优化，从而确定其最佳测定条件，为石榴皮多酚的研究与开发提供依据。

目前常规测定植物多酚含量的方法有酒石酸亚铁法［11］、高锰酸钾法［12］、普鲁士兰法［13］等，但酒石酸亚铁法对儿茶素类物质有专属性，高锰酸钾法具有误差大、操作繁琐等缺点［14］，普鲁士兰法有测定多酚时数据不稳定、误差大等缺点［15］。Folin-Ciocalteu法比较简单，是植物多酚类物质常用的测定方法。但植物来源不同，会导致分析条件不同［16-18］。因此对石榴皮中多酚类有必要探索一个简单、科学、准确的分析方法。本研究采用Folin-Ciocalteu比色法测定石榴皮中多酚类含量，并对Folin-Ciocalteu试剂（FC试剂）用量、Na2CO3试剂用量、反应时间等因素进行了优化，建立了测定石榴皮中多酚类含量的方法，为石榴皮的利用提供基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器、试剂

UV-1800PC-DS2型紫外—可见光分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；752型紫外—可见光分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；RE52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；B-220型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（北京世纪华科实验仪器有限公司）；FC试剂（国药集团化学试剂有限公司）；其他均为上海国药试剂集团分析纯试剂。

1.2 试药

石榴皮，取自云南蒙自石榴果园，经本校药学系中药教研室蒋燕老师（执业中药师）鉴定为石榴科石榴属植物Punica granatum L.的果皮；没食子酸（中国食品药品检定研究院，批号110831-201605）。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 对照品溶液的配制

准确称取0.04 g没食子酸，用蒸馏水溶解并定容至1000 ml容量瓶中，即得到质量浓度为40 μg/ml的对照品溶液，避光保存。

2.1.2 供试品溶液

将新鲜石榴皮洗净，50℃鼓风干燥24 h，粉碎，过40目筛。称取该粉末100 g，加70%乙醇配成料液比为1∶20的溶液，搅匀，保鲜膜封口，在超声清洗仪中（50℃）超声30 min。过滤，并在40℃下真空旋转蒸发浓缩干燥，得石榴皮提取物干粉5.4 g。精确称取提取物干粉0.2 g，精密配制成质量浓度为200 μg/ml的样品液。

2.2 多酚含量测定的影响因素试验

2.2.1 最佳测定波长的确定

精确移取1.0 ml的没食子酸标准溶液和石榴皮多酚溶液，参照茶叶多酚的测定方法［19］，分别加入5.0 ml浓度为 10%（V/V）FC 试剂，静置 2 min，加 7.5%（V/V）Na2CO3试剂4.0 ml，使其充分反应，室温避光120 min。以空白试剂为对照，用紫外可见分光光度计在200～800 nm波长下全波长光谱扫描（图1）。图1可见，没食子酸标准品、石榴皮多酚溶液分别与FC试剂反应后的光谱曲线有相似的形状，出现了2个吸收峰值，分别是330 nm和750 nm。在330 nm处，FC试剂本身有吸收峰，因此测定石榴皮多酚含量可选用没食子酸作为标准物质，750 nm为测定最佳波长。

图1 显色反应后没食子酸标准品与石榴皮多酚溶液的紫外全波长扫描曲线

1 -：没食子酸与FC试剂反应混合液；2-：石榴皮多酚溶液与FC试剂反应混合液；3-：FC试剂

2.2.2 石榴皮多酚含量测定的影响因素试验

2.2.2.1 FC试剂浓度的影响试验取50 ml容量瓶，加入1.0 ml石榴皮多酚液，再依次加入5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的 FC 试剂，按照

2.2.1 确定的最佳条件依次测定吸光度值（A750值）（图2）。图2可见，随着FC试剂浓度的增加，石榴皮多酚溶液的A750值先增高后降低。在FC试剂浓度为40%时达到最大值，其后随着浓度的增加而下降。当FC试剂浓度达60%时，反应液渐有气泡发生（反应产生CO2），且随着浓度进一步的增加，反应液气泡量随之增多，需排除后才能测定。FC试剂浓度达80%后，反应液出现沉淀，对吸光度的测定产生不利影响。因此选择40%作为FC试剂的最佳浓度。

图2 FC试剂浓度对石榴皮多酚溶液吸光度的影响

2.2.2.2 Na2CO3试剂浓度的影响试验精确移取1.0 ml石榴皮多酚溶液，加入40%FC试剂液，并行加入不同浓度的Na2CO3试剂（浓度分别为2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%），按照2.2.1中确定的最佳条件测定A750值（图3）。图3可见，石榴皮多酚液的吸光度随Na2CO3试剂浓度的增大而上升。当Na2CO3试剂浓度为5.0%时，反应液呈黄绿色，反应不完全，与文献报道相似［20］。当Na2CO3试剂浓度达10%时，石榴皮多酚溶液的A750值达到最大，后随着浓度的增加而缓慢下降。因此选择10%作为Na2CO3试剂最佳浓度。

图3 Na2CO3试剂浓度对石榴皮多酚溶液吸光度的影响

2.2.2.3 反应温度的影响试验精确移取1.0 ml石榴皮多酚溶液，加入浓度为40%的FC试剂和10%的Na2CO3试剂，分别在温度为 20、25、30、35、40℃的条件下，按照2.2.1中确定的最佳条件分别测定A750值（图4）。图4可见，石榴皮多酚溶液的A750值随反应温度变化不大。在反应温度20℃后略有下降，至35℃后止降后稍有上升。在20℃时，石榴皮多酚溶液的A750值达到最大。因此，确定20℃为反应最适温度。

图4 反应温度对石榴皮多酚溶液吸光度的影响

2.2.2.4 反应时间的影响试验精确移取1.0 ml石榴皮多酚溶液，按照2.2.1中方法进行试验（40%FC试剂、10%Na2CO3试剂、反应温度20℃），每隔 20 min测定A750值，直至180 min（图5）。图5可见，石榴皮多酚溶液的吸光度随反应时间的增加出现先升后降的趋势，但整体变化幅度不大。在100～120 min时出现峰值，故选择100 min作为反应最适时间。

图5 反应时间对石榴皮多酚溶液吸光度的影响

2.3 标准曲线的绘制

筛选出如上测定条件并制作标准曲线，分别精确量取浓度为 0、15、30、45、60、75 μg/ml的没食子酸标准品溶液各1.0 ml，平行加入40%FC试剂5.0 ml，混匀，静置 2 min，加入 10%Na2CO3试剂 4.0 ml，摇匀，25℃下避光反应100 min，测定A750值。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线（图6），其回归方程式为：y=0.01475x+0.00686，R2=0.99980。没食子酸标准溶液的吸光度与质量浓度在0～75 μg/ml范围内线性关系良好，该方程可用于石榴皮提取液中多酚含量的计算。

图6 没食子酸标准曲线

2.4 FC比色法测定效果的评定

2.4.1 稳定性试验

按照优化条件进行显色反应后，测定4℃下分别放置 2、3、4、5、6 和 7 h 时石榴皮多酚溶液的 A750值，检测FC法的稳定性。结果显示，石榴皮多酚溶液的A750值依次为 0.427、0.424、0.419、0.408、0.399、0.386。数据显示，石榴皮多酚溶液的A750值在7 h内变化很小，相对标准偏差（RSD）=1.59%，提示该方法稳定性良好。

2.4.2 精密度试验

分别精确移取6份1.0 ml石榴皮多酚溶液置比色管中，按照优化后条件进行A750值测定，计算RSD，评价仪器的精密度。结果显示，对样品进行平行测定的 A750值分别为 0.427、0.429、0.445、0.419、0.438、0.399，6次测定结果的RSD为1.73%，提示仪器的精密度良好。

2.4.3 回收率试验

按上述实验优化后的条件，采用加标回收法，分别测定已知含量的石榴皮多酚提取液加入不同量（高、中、低水平）的没食子酸标准品后的多酚含量，并计算其回收率和RSD（表1）。表1可见，用该方法对石榴皮多酚含量测定时，没食子酸的加标回收率为96.48%～102.05%，平均回收率为 99.51%，RSD为2.56%（n=5），提示该方法准确度较高，可用于石榴皮多酚含量测定。

表1 石榴皮多酚测定的回收率试验结果（n=5）

2.5 样品测定

制备1.0 ml石榴皮多酚供试液6份，按照优化后条件进行A750值测定，计算石榴皮样品中多酚的含量。经测，石榴皮多酚溶液

，计算得石榴皮多酚溶液的含量为（142.42±5.88）mg/g。

3 讨论

中药材多酚含量的检测常采用光谱法和色谱法，前者包括分光光度法、红外光谱法和核磁共振光谱法，高效液相色谱法、薄层色谱法和毛细管电泳法等均为后者常见的检测方法［21］。其中，UV-FC法为最广泛应用的总酚含量测定方法。其原理为钨钼酸在pH显碱性的环境条件下，能够被酚类物质还原（W6+变为W5+），还原产物中蓝色络合物的深浅与多酚含量多少成正相关。Folin-Ciocalteu法具有重现性好、快速、稳定精密度高、回收率佳、操作简便等优点。目前文献报道不同石榴皮原料多酚含量测定条件，如测定波长、FC试剂用量、显色温度、显色时间以及碱液浓度等测定条件有着较大差异［22］。

本研究结果显示，FC法测定石榴皮提取物中多酚含量的最佳条件为：取样品液1 ml、40%FC试剂5 ml、10%Na2CO3试剂4 ml、在 20℃避光反应 100 min为最佳反应条件；多酚含量与750 nm处吸光度呈良好线性关系；本法加标平均回收率为99.51%，RSD为2.56%。

Folin-Ciocalteu测定多酚含量时易受其他还原性物质如还原糖类、芳香氨基酸、抗坏血酸等物质的干扰［23］，这些物质对石榴皮多酚含量测定的影响有待进一步研究。

综上所述，优化后的Folin-Ciocalteu比色法方便稳定，是检测石榴皮中多酚含量的可靠方法。

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