婴幼儿时期，由于中枢神经系统尚未成熟，惊厥阈值低［1］，各种环境危险因素（损伤或者应激）作用于该时期的大脑易诱发癫痫发作［2］。West综合征是一种年龄依耐性癫痫综合征，既往研究报道促皮质激素释放激素（corticotrophin releasing hormone，CRH）与该病发病密切相关［3］，然而迄今为止，其间的具体关系仍知之甚少。Baram等［4］报道，在婴幼儿鼠的侧脑室灌注CRH可以诱导严重的惊厥，成年大鼠侧脑室灌注100倍于幼鼠剂量的CRH，则未诱发出惊厥行为，提示CRH诱发惊厥具有年龄依赖性，实验证实CRH诱导的惊厥起源于杏仁核［5］。Ehlers 等［6］报道CRH 可以增加杏仁核点燃惊厥活动的后放电时程，杏仁核和海人酸点燃的癫痫模型同样可以增加CRH的释放［7-8］，提示CRH与癫痫发生发展密切相关，然而CRH其诱导癫痫的具体机制是什么？目前仍不清楚，所以，本实验通过脑室微量灌注实验及全细胞膜片钳检测CRH对海马锥体神经元膜电位的影响，初步探讨CRH诱导幼鼠惊厥样行为的初步机制。

35 只新生的 Sprague-Dawley（SD）大鼠幼鼠，出生当天计为P0，饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境，自由进食，于贵州医科大学动物实验中心购买，合格证号为 SCXK（黔）［2002-0001］。

1.2.1 分组及方法 实验按需要完全随机分为空白实验组（仅侧脑室埋植导管，n=10）、人工脑脊液灌注组（侧脑室灌注人工脑脊液，n=10）、CRH灌注组（侧脑室灌注CRH，n=10）。CRH试剂购于上海Segma公司，本实验获得了贵州省人民医院医学伦理委员会的批准。

1.2.2 侧脑室灌注模型制作 生后17 d，10%水合氯醛按3 ml/kg麻醉幼鼠，将其固定在幼鼠立体定位仪上，根据SHERWOOD AND PAOLA婴幼儿鼠定位图谱右侧侧脑室坐标（前囟后1 mm，旁开1.5 mm，深3.3 mm），带管芯套管通过钻空垂直插入左侧侧脑室，并同时埋植皮层电极，然后采用不锈钢螺钉加牙科水泥固定，保暖单独饲养，术后腹腔常规注射青霉素50 000 U预防感染，次日早上 9：00～11：00统一行侧脑室灌注实验。

1.2.3 脑电图记录方法及惊厥行为分级 先把幼鼠放于2 L的烧杯中，保暖适应环境后30 min后，在自由活动状态下安静环境中用多导生理记录仪记录背景脑电5 min，然后通过用带套管的微注射泵注入CRH溶液（0.1 mg溶入1.5 ml的生理盐水）或等量的人工脑脊液，按1 μl/min泵入，直到诱发惊厥行为，连续监测 EEG。 行为学按 Racine分级方法［9］，具体如下。1级：面部阵挛，包括动须、咀嚼等；2级：1级发作行为加节律性点头；3级：2级行为加前肢阵挛；4级：3级行为加后肢站立；5级：4级行为加摔倒。实验过程中死亡、导管脱落的幼鼠不计入实验总体。

1.2.4 海马脑片制作 乙醚麻醉18 d大的幼鼠（n=5），迅速断头取脑，置于0～4℃冰冷，pH=7.4左右、渗透浓度290～310 mol/L的人工脑脊液5 min，快速分离海马，用振动切片机切300～400 μm厚的脑片，迅速转移到自配的人工脑脊液中37℃孵箱孵育1 h。

1.2.5 海马脑片锥体神经元全细胞膜片钳记录 分别记录CRH灌洗前、中、后海马锥体神经元自发性放电特征，每个神经元于CRH灌洗前、中、后记录自发性放电5～10 min，并计算动作电位发放频率适应性的大小。

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，不符合正态分布者转换为正态分布后行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

CRH灌注组10只幼鼠有1只麻醉死亡，一只侧脑室埋植导管脱落，有8只幼鼠诱发出惊厥样行为，幼鼠侧脑室灌注CRH（5±3）μl可以诱导出惊厥，且均能在皮层记录到痫样放电；空白实验组有2只死亡，1只导管脱落，人工脑脊液灌注组有2只导管脱落，两组幼鼠均未观察到惊厥行为，皮层均未记录到痫样放电。

CRH灌洗海马脑片锥体神经元自发性放电频率为（5.67±1.75）Hz，明显快于CRH灌洗海马脑片前锥体神经元自发性放电频率［（2.23±1.12）Hz］及 CRH 灌洗海马脑片后锥体神经元自发性放电频率［（1.28±0.72）Hz］（P＜0.01），CRH 灌注前同样要快于 CRH 灌洗后的自发性放电频率（P＜0.05）（图 1）。

CRH灌洗时动作电位的发放频率适应性大小为1.35±0.62，与灌洗前的 2.05±0.81 和灌洗后的 1.97±0.64相比，CRH灌洗明显降低锥体神经元动作电位的发放频率适应性（P＜0.05）（图 2）。

笔者前面实验证实母子隔离应激可以增加幼鼠癫痫的易感性［10］，Shang 等［11］报道孕期应激是子代患婴儿痉挛综合征的高危因素，提示应激与癫痫的发病密切相关。CRH作为经典的应激因子，在癫痫发生、发展中扮演重要角色，CRH是含有41个氨基酸残基的多肽类激素［12］。海马、杏仁核部位同样可以分泌CRH，并且这两个属于边缘系统的脑区是癫痫发生和发展的关键部位。

本实验通过幼鼠侧脑室埋植导管，微量灌注CRH，可以诱发出幼鼠惊厥发作，皮层记录到放电现象，这与Baram等［4］的报道相符，而人工脑脊液灌注组及空白实验组始终未观察到惊厥行为，皮层未记录到放电现象，提示CRH可直接诱发未成熟脑惊厥发作。

锥体神经元作为海马主要的兴奋性神经元，以谷氨酸作为兴奋性神经递质，其包体呈典型的锥体状，放电频率一般为1～4 Hz，有明显的动作电位的发放频率适应性。利用全细胞膜片钳技术，本研究显示CRH可通过增加海马锥体神经元的自发性放电频率，降低锥体神经元动作电位的发放频率适应性，从而增加锥体神经元的兴奋性，提示过度的应激可以导致海马应激因子（CRH、去甲肾上腺等）释放增加［13］，这些应激因子可通过不同途径增加海马神经元的兴奋性。应激因子去甲肾上腺素通过α1受体的介导，降低了中间神经元对锥体细胞的抑制作用，从而增加其兴奋性［14］；CRH可增加在大鼠海马CA1区域细胞自发性放电而抑制动作电位爆发后的超级化反应［15］，在海马CA3区，CRH（特别是高浓度）可以诱导神经元去极化。在GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱存在的情况下，用CRH刺激海马脑片的苔藓纤维可以增加兴奋性突触后电位的频率和爆发动作电位数量［16］。其同样可以易化齿状回的长时程电位增强（LTP）［17］，更重要的是有实验证实特异性地阻断CRH受体可以抑制癫痫的发生［18］。

在海马脑片全细胞膜片钳实验中，CRH灌洗前锥体神经元的自发性放电频率快于CRH灌洗后锥体神经元的自发性放电频率，这可能与CRH神经兴奋毒性有关。国外有文献报道显示，急性或慢性应激可抑制海马CA3区神经细胞树突的生长，甚至导致神经细胞凋亡［19］。

本实验提示幼鼠侧脑室灌注微量的CRH可诱发惊厥发作，并且CRH导致海马锥体神经元兴奋性的增加可作为其潜在机制，这对应激参与未成熟脑癫痫发病机制的研究有重要意义，然而CRH致痫的具体机制有待进一步研究。

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Preliminary mechanism study of convulsive behavior induced by corticotropin releasing hormone infusion into lateral ventricle in immature rats

ZHOU Hao ZHAO Wei-qing CUI Yu-xia LIU Kai-yu▲
Department of Pediatric，Guizhou Provincial People′s Hospital，Guizhou Province，Guiyang 550002，China

[Abstract]Objective To investigate the preliminary mechanism study of convulsive behavior induced by corticotropin releasing hormone（CRH）infusion into lateral ventricle in immature rats.Methods All SD immature rats were randomly divided into the blank experimental group （only lateral ventricular implant catheter，n=10），the artificial cerebrospinal fluid perfusion group（lateral ventricular perfusion artificial cerebrospinal fluid，n=10），the CRH perfusion group（lateral ventricular perfusion CRH，n=10）.The SD immature rats were performed lateral ventricle infusion at 18 days after birth and using the lateral ventricular microperfusion and whole-cell patch clamp to detect the influence of CRH for membrane potential of pyramidal neurons at hippocampal.Results Convulsion behavior could be induced by CRH of（5±3）μl infusion into the lateral ventricle of SD immature rats，while the other groups were not clearly observed.The spontaneous discharge frequency of pyramidal neurons in CRH infusion in hippocampal slices was（［5.67±1.75］Hz），which was significantly faster than before CRH infusion in hippocampal slices （［2.23±1.12］Hz）and after CRH infusion in hippocampal slices（［1.28±0.72］Hz）（P＜0.01）.Conclusion CRH administered into cerebral ventricles can induce convulsive behavior in immature rats，and increasing excitability of pyramidal neurons，which can be used as the potential mechanisms.

[Key words]Corticotrophin releasing hormone;Hippocampus;Immature brain;Epilepsy

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2019）2（c）-0026-04

［基金项目］贵州省科技计划项目（黔科合基础［2016］1091）

收稿日期：2018-11-21

本文编辑：祁海文