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MG-132是蛋白酶体的阻断试剂，阻断后可使之失去活性[1]。泛肽-蛋白酶体（ubiquitin proteasome）是广泛存在于真核细胞中，其能快速处理和降解蛋白质的非溶酶体物质，蛋白酶体是指有蛋白降解作用的酶复合体。MG132是一种肽醛，可以有效地阻断蛋白酶体的蛋白水解活性，包含苄酯基-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸序列[2]。据报道，蛋白酶体的抑制剂（包括MG132）可以通过形成活性氧（ROS）从而诱导细胞凋亡。蛋白酶体抑制剂引起的ROS的形成和谷胱甘肽（GSH）的耗竭可导致线粒体功能障碍和随后细胞色素C的释放，从而导致细胞活力的丧失[3-4]。在细胞质中蛋白酶体亚群是与内质网（ER）表面、细胞骨架[5]、中心体相伴随。大多数细胞内蛋白质，包括调节细胞周期的多种蛋白均有此通路降解[6]。

TRAIL（TNF related apoptosis inducing ligand）基因最早由Wiley等[7]在1995年从人心肌cDNA文库中克隆得到并命名，1996年Pitti等[8]克隆到同样的基因，并命名Apo22L。由于其氨基酸序列具有TNF超家族的结构特征，并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类B淋巴细胞凋亡，故命名为TNF相关的凋亡诱导配体。但是有研究发现，某些肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡作用并不理想，这限制了TRAIL在抗肿瘤治疗中的应用[9]。本实验基于TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡，探讨蛋白酶体通路等因素对于其治疗效果的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

MG-132购自Cell Signaling公司；新西兰新生牛血清购自Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶、四氮唑蓝（MTT）及双抗购自Sigma-Aldrich公司；Annexin VFITC凋亡检测试剂盒购自Ambion公司；骨肉瘤细胞U-2 OS购自上海信然公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物干预方案骨肉瘤细胞U-2 OS置于含10%小牛血清的1640培养液中，在37℃、5%CO2饱和度的培养箱中培养。待细胞进入对数生长期时，以1×105/ml浓度接种于培养板中，培养24 h后给药。单用 TRAIL 组选用 400、600、800、1000 μg/L 4 种浓度；单用 MG-132 组选用 5、10、15、20 μmol/L 4 种浓度，联合应用组选用800 μg/L TRAIL以及15 μmol/L MG-132合用。在应用上述3种给药方案24 h后，分别对诱导MG-63细胞凋亡状况进行检测。

1.2.2 Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率实验组给予 400、600、800、1000 μg/L TRAIL，5、10、15、20 μmol/L MG-132 以及联合组，并设立空白对照组，24 h进行检测。用配备好的洗涤液洗细胞3次，重悬细胞至 1 ×106/ml，取 100 μl细胞（105cells）至 5 ml管内，加入5 μl培养液混匀，室温下避光培养20 min，每管加入 400 μl 1×Binding Buffer，1 h 内上流式细胞仪检测。

1.2.3 MTT法测定细胞的生长抑制效应将1×106/ml细胞接种于96孔板，每孔100 μl，贴壁后加入不同浓度药物细胞培养基，每孔100 μl，每种浓度平行5孔，培养24 h后，每孔加入10 μl新配制的10 mg/ml的MTT，37℃继续孵育分别于 0、24、48、72 h，弃上清加150 μl DMSO溶解，混匀后在540 nm波长测定吸光度。肿瘤细胞抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A 值）×100%。

1.3 观察指标

于0、24、48、72 h在显微镜下观察细胞形态变化及细胞抑制率。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 13.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，采用 t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下观察细胞形态

光镜下可见单纯应用TRAIL及MG-132分别作用于骨肉瘤细胞U-2 OS后，随时间推移，细胞形态出现相应变化，24 h后肿瘤细胞开始变小，48 h部分肿瘤细胞进一步变小并脱落，72 h后大多数肿瘤细胞脱落并聚集成团块。TRAIL和MG-132联合作用时，上述现象更明显（图1）。

图1 各时点混合组细胞光镜下照片

2.2 流式细胞仪结果

2.2.1 单用TRAIL组流式细胞仪结果单用400、600、800、1000 μg/L TRAIL 的细胞凋亡率分别为（5.7±1.0）%、（6.4±2.3）%、（7.1±2.5）%、（8.6±2.1）%，结果显示，随着给药浓度的增加，凋亡率也随之增高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 单用TRAIL组流式细胞仪结果

A：400 μg/L TRAIL；B：600 μg/L TRAIL；C：800 μg/L TRAIL；D：1000 μg/L TRAIL

2.2.2 单用MG-132组流式细胞仪结果单用5、10、15、20 μmol/L 的 MG-132 细胞凋亡率分别为（6.9±1.5）%、（7.8±1.3）%、（8.5±2.1）%、（9.2±1.3）%，结果显示，随着给药的浓度，凋亡率也随之增高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 MG-132组流式细胞仪结果

A：5 μmol/L MG-132；B：10 μmol/L MG-132；C：15 μmol/L MG-132；D：20 μmol/L MG-132

2.2.3 联合组流式细胞仪结果空白对照组、单用800μg/L TRAIL组、单用15 μmol/L MG-132组及联合组的细胞凋亡率分别为（2.8±0.6）%、（7.1±2.5）%、（8.5±2.1）%、（9.8±1.2）%，不同用药浓度，凋亡率也随之变化，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 联合组与空白对照组、15 μmol/L MG-132、800 μg/L TRAIL流式细胞仪结果的比较

A：空白对照组；B：15 μmol/L MG-132；C：800 μg/L TRAIL；D：联合组（800 μg/L TRAIL+15 μmol/L MG-132）

联合组、单用TRAIL组和单用MG-132组分别与空白对照组比较，骨肉瘤细胞凋亡率均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且单用MG-132组高于单用TRAIL组，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组骨肉瘤细胞凋亡率明显高于单用TRAIL组和单用MG-132 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 各组流式细胞仪检测的细胞凋亡率的比较

2.3 MTT测得抑制率结果

随着时间的推移，细胞抑制率上升，而联合组的抑制率明显高于单用TRAIL组和MG-132组，在72 h处达到最大值 [（82.32±2.54）%]，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

图5 三组细胞抑制率比较

3 讨论

生物治疗作为继传统肿瘤治疗手段后的又一种治疗方法，在肿瘤治疗中越来越显示出其特殊性及优越性[10-11]。特别是对骨恶性肿瘤的治疗，已有大量的基础研究报告。TRAIL是1995年克隆的TNF超家族新成员，与其受体（TNF related apoptosis inducing ligand receptor，TRA ILR）相结合后能启动细胞内的调节细胞凋亡的信号转导，诱导细胞凋亡，但对部分肿瘤细胞的作用不敏感[12-14]。

MG-132是泛素-蛋白酶体的阻断剂，能有效阻断多种调节蛋白的降解，在诱导细胞凋亡过程中起到重要作用。有研究认为蛋白质的泛肽化与包括细胞凋亡在内的许多细胞活动过程有关[15-17]。

近来有研究发现，泛肽-蛋白酶体通路可能参与了多种凋亡调节蛋白和转录因子的降解，在细胞凋亡的调控中起着非常重要的作用。Soldalenkov等[18]发现，当泛肽-蛋白酶体阻断后会引起某些细胞出现凋亡。推测：在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡过程中存在某些调节蛋白，可大大提高TRAIL诱导凋亡的作用，而这些调节蛋白很大可能是由蛋白酶体通路所降解，阻断凋亡的传单，增加肿瘤细胞对TRAIL的抵抗性。泛肽-蛋白酶体阻断后，可在很大程度上保证这些调节蛋白的存在，大大提高TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。本研究着重探讨泛素-蛋白酶体与TRAIL诱导的细胞凋亡之间的相互关系。单一使用TRAIL诱导骨肉瘤细胞U-2 OS凋亡效果较差，联合MG-132后抑制效果显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05），显示出一定的临床应用价值。目前临床上治疗肿瘤的传统方法是手术、放疗、化疗相结合的方法，但对正常细胞有极大的杀伤作用，限制了其治疗效果。TRAIL以其高效低毒的生物学特点，给肿瘤治疗带来了新的希望[19-20]。其内在机制并未被完全阐释清晰，仍需进一步深入探讨。

综上所述，TRAIL可诱导骨肉瘤细胞U-2 OS凋亡，但效果不太理想。混合使用MG-132后，可大大提高TRAIL诱导U-2 OS凋亡的效果。

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