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壬基酚（nonylphenol，NP）是环境雌激素的一种，在日常生活中随处可见，如洗涤剂、柔顺剂、滑油添加剂、食用塑料产品以及工业橡胶制品，其广泛地存在于生态环境中，可以通过皮肤暴露和食物以及污水进入人体，并且有蓄积性[1]和持久性，对人体的内分泌系统可造成危害，影响人类健康。人类精子质量和数量下降、男性生殖系统发育异常考虑可能与有雌激素活性的外来化合物有关[2－4]。研究表明，NP[5]、双酚 A 等雌激素样物质在离体实验条件下能明显促进前列腺癌细胞PC-3增殖，推测与男性生殖系统发育异常、生殖障碍有密切关系。全世界的学者对NP造成的危害越来越重视，已有学者做过卵巢损伤后储备功能减退的相关研究，外界环境因素能使机体免疫反应发生改变，从而导致成熟性卵泡的缺失[6]。郭金莲等[7]发现NP剂量达到100 mg/kg可对大鼠的生殖功能产生抑制，改变激素水平及卵泡数目。实验表明NP还可以对雌性大鼠的免疫[8]功能以及雄性大鼠的生殖[9]功能产生损伤，促进癌细胞的增殖[10]。还有证据表明，高剂量的NP可抑制睾酮[11]的分泌。

目前国内外对NP对小鼠卵巢功能氧化损伤的研究较少，故进行本研究。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

KDC-1044型低速离心机；电子天平；光学显微镜。NP原液（购买于常州染料化工厂，纯度＞95%），超纯水，鲁花牌玉米油，雌激素（E2）、孕激素（P）、促性腺激素（FSH）ELISA试剂盒均购于南京建成生物公司。NP染毒溶液的配制：精准称取适量的NP溶于玉米油中，配制成浓度分别为2.5、10 mg/ml的NP溶液。

1.2 实验的动物的分组及染毒方法

选择30只健康清洁（SPF）级昆明种雌性小鼠，体重18～22 g，年龄6～8周，动物合格证号：SCXK（京）2014-0004，由华北理工大学动物实验中心提供。室温22～24℃，湿度合适，通风系统正常的无菌环境中，喂养标准颗粒型饲料。实验期间小鼠自由摄食饮水。

适应性喂养1周后，将30只小鼠随机分为三组[11]，分别为对照组（玉米油），25 mg/kg、100 mg/kg NP 组，每组10只。灌胃染毒[12-13]，染毒容量为0.1 ml/10 g，每天1次，每周5 d，连续染毒12周。每日观察小鼠的一般精神状态、活动、进食饮水量等情况，记录小鼠的体重。

1.3 小鼠卵巢重量及其脏器系数的测定

末次染毒结束24 h后，称重并摘眼球取血，迅速分离双侧卵巢及子宫进行称重，并计算卵巢系数（卵巢系数=卵巢重量/体重×100%）；除部分卵巢组织送病理形态学检测外，均冻存于-80℃，备用。

1.4 小鼠血清E2、P、FSH水平的的测定

末次染毒结束24 h后，摘眼球取血后，静置10 min，离心（2000 r/min）×10 min，取上清液，检测 E2、P、FSH，具体操作步骤严格按照南京建成生物公司所购买的试剂盒说明书进行。

1.5 小鼠卵巢组织病理学观察

每组选取2只小鼠卵巢，常规固定、脱水、浸透、包埋，制成5 μm厚的切片，乙醇梯度脱水，常规HE染色，于光学显微镜下观察小鼠卵巢组织病理形态并摄片，镜下每张切片随机选取3个视野，计数总卵泡数、初级卵泡数及成熟卵泡数和闭锁卵泡数目。

1.6 统计学方法

采用Excel 2003建立数据库，使用SPSS 17.0软件处理数据，计数资料以均数±标准差表示，多组之间比较采用方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

染毒期间对照组的小鼠精神状态良好，皮毛光泽度，活动度，粪便、进食饮水量均正常。25 mg/kg NP组大鼠的精神状态一般，皮毛光泽度较差，活动稍减少，粪便、进食饮水量相对正常。100 mg/kg NP组大鼠的精神状态委靡，皮毛光泽度下降，活动明显减少，进食及饮水量减少。

2.2 体重变化

染毒第6、12周，25 mg/kg NP组与对照组组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），100 mg/kg NP组与对照组、25 mg/kg NP组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 三组小鼠染毒前、染毒第6、12周体重的比较（g，

±s，n=10）

与对照组同时间比较，*P＜0.05；与25 mg/kg NP组同时间比较，#P＜0.05

2.3 三组小鼠卵巢湿重及卵巢系数的比较

25 mg/kg NP组小鼠的卵巢湿重及卵巢系数与对照组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），100 mg/kg NP组小鼠的卵巢湿重及卵巢系数与对照组、25 mg/kg NP 组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

表2 三组小鼠卵巢湿重及卵巢系数的比较（

±s，n=10）

与对照组比较，*P＜0.05；与 25 mg/kg NP 组比较，#P＜0.05

2.4 三组小鼠血清中E2、P、FSH水平的比较

100 mg/kg NP组小鼠血清中E2、P、FSH水平明显低于对照组、25 mg/kg NP组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；25 mg/kg NP 组小鼠血清中 E2、P、FSH 水平低于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表 3）。

表3 三组小鼠血清中 E2、P、FSH 水平的比较（pg/ml，

±s，n=10）

与对照组比较，*P＜0.05；25 mg/kg NP 组比较，#P＜0.05

2.5 三组卵巢组织卵泡数目和卵巢病理形态学结果的比较

25、100 mg/kg NP组小鼠卵巢组织总卵泡、初级卵泡、成熟卵泡数目分别与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表 4）。

表4 三组卵巢组织卵泡数目的比较（个，

±s，n=6）

与对照组比较，*P＜0.05

100 mg/kg NP组小鼠卵巢HE染色，40倍镜下与对照组比较，原始卵泡及生长卵泡的数目减少，闭锁卵泡数目增多，200倍镜下可见初级卵母细胞明显萎缩，卵巢颗粒细胞松散，卵母细胞核固缩，卵泡腔变小（图 1～4，见封四）。25 mg/kg NP组小鼠卵巢 HE 染色，200倍镜下与对照组比较可见少数初级卵母细胞，卵巢颗粒细胞松散，卵母细胞核固缩（图5，见封四）。

图1 对照组卵巢组织HE（40×）（见内文第6页）

图2 100 mg/kg NP组卵巢组织HE（40×）（见内文第6页）

图3 对照组卵巢组织HE（200×）（见内文第6页）

图4 100 mg/kg NP组卵巢组织HE（200×）（见内文第6页）

图5 25 mg/kg NP组卵巢组织HE（200×）（见内文第6页）

3 讨论

NP主要经皮肤及污水进入人体，影响人类的内分泌系统，证据表明，围生期暴露雌激素干扰物可导致出生缺陷及发育异常[14]。一方面儿童性早熟[15]与NP密不可分。随着工业发展，人们更多地暴露于NP。叶丽杰等[16]的动物实验结果有证据证明NP经口持续染毒，当剂量达到60 mg/kg时，雄性小鼠的精子数量减少，活精率下降，畸形率增高。本研究采用昆明种雌性小鼠经口染毒的实验方法，各染毒组小鼠的体重、卵巢湿重以及卵巢系数无显著差异，可能与小鼠种类、特定的生长发育周期、染毒时间及浓度等不同有关，尚不能证明两者之间无明显关联。各组小鼠卵巢的各级卵泡与对照组比较，均有所减少（P＜0.05）。高剂量NP作用下小鼠卵巢的闭锁卵泡明显增多，血清中P、FSH较对照组明显降低（P＜0.05）；卵泡闭锁数目增多的机制尚未明确，有人考虑与卵泡微环境内的激素下降，营养支持作用不足有关，同时伴随卵母细胞凋亡和颗粒细胞排列松散，顺序紊乱等[7]。低剂量NP作用下激素水平与对照组比较未见明显变化（P＞0.05），考虑NP有剂量蓄积作用，应延长染毒时间。本研究因为样本量较少，实验方法存在误差和局限性，可增大样本量，改善实验方法以及实验仪器的的精准度，降低实验误差。

综上所述，NP对小鼠卵巢有生殖毒性和发育毒性。人类的生育功能下降，是否与NP在日常生活中的暴露量成正相关，还需进行大量的流行病学调查和论据充分有效的动物实验。NP类化合物在生活中越来越多，有必要继续进行相关的动物实验，进一步关注和明确NP对人类及野生动物生殖健康的危害，从而更有效地预防。

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