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心房颤动（Atrial fibrillation）是临床上常见的持续性心律失常，其总体发病率为1%～2%。我国大规模流行病学研究显示，中国成年人患病率为0.77%，男性（0.9%）高于女性（0.7%），并且随年龄增加患病率显著增高，80岁以上人群患病率可达7.5%[1] 。一项对全国22家省级医院心内科住院患者的回顾性调查显示，心内科住院患者中心律失常占26.8%，其中房颤所占比例为35.0%[2] 。目前关于房颤发生的机制尚不清楚，目前多认为与心房重构、电重构、神经重构有关[3] 。房颤的病因多与遗传、高血压、冠心病、心肌病和风湿性心脏病等有关[4] 。国内风湿性心脏病合并心房颤动患者仍占较大的比例，而且此类患者脑血管事件发生较多，致残、致死率高，为患者和社会带来严重负担。目前的研究结果显示，miR-1、miR-26、miR-133、miR-590、miR-21、miR-29 等都与心房颤动发病有关[3，5] ，而关于风湿性心脏病合并心房颤动与miRNA的研究较少。有研究显示，风湿性心脏病合并心房颤动患者心房组织中的miR-328表达上调，约为正常组的3.5倍，并通过靶基因预测及细胞学研究证实miR-328的靶基因是CACNA1C和CACNB1同时可调控L型Ca2+ 通道的两种亚基蛋白，通过对L型Ca2+ 流产生影响达到缩短动作电位时程而参与房颤的电重构[6] 。对人体心房颤动发病机制进行研究具有一定难度，主要难以获取心脏组织，近期研究显示，循环miRNA在血浆、尿液等稳定存在可作为疾病诊断和治疗的标志物，该方法样本获取较为简单[3，7-9] 。本研究旨在探讨血浆循环miRNA-328-3P是否与风湿性心脏病合并心房颤动的发病有关，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月～2018年7月于湖南省郴州市第四人民医院心血管内科住院的19例风湿性心脏病合并心房颤动患者作为观察组，选取同期21例风湿性心脏病窦性心律患者作为对照组。观察组中，男6例，女 13 例；平均年龄（67.40±2.48）岁；平均收缩压（127.20±8.21）mmHg；吸烟史 4 例；平均血糖（6.99±1.40）mmol/L；平均总胆固醇（5.21±0.26）mmol/L；平均三酰甘油（1.28±0.16）mmol/L；平均高密度脂蛋白（1.35±0.08）mmol/L；平均低密度脂蛋白（3.26±0.22）mmol/L。对照组中，男10 例，女 11 例；平均年龄（67.05±2.77）岁；平均收缩压（123.10±8.95）mmHg；吸烟史 6 例；平均血糖（6.35±0.66）mmol/L，平均总胆固醇（5.24±0.26）mmol/L；平均三酰甘油（1.58±0.17）mmol/L；平均高密度脂蛋白（1.29±0.06）mmol/L；平均低密度脂蛋白（3.17±0.23）mmol/L。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有患者均知情同意；本研究已经湖南省郴州市第四人民医院医学伦理委员会审核批准。纳入标准：明确诊断为风湿性心脏病（心脏彩超确诊）者；明确诊断患有心房颤动或者窦性心律（心电图确诊）者；年龄45～75岁者。排除标准：严重肝肾功能不全、恶性肿瘤者；妊娠或哺乳期妇女。

1.2 方法

两组患者于入院24 h内抽取2 ml静脉血，并分离血浆（3000 r/min，4℃，10 min，eppendorf离心机离心半径10 cm），保存于-80℃冰箱，以备后续试验用，收集患者基本病史和生化检测指标。

首先用 Trizol（Invitrogen，美国，批号：15596026）按照说明书提取所获取血浆的总RNA，按照miRNA逆转录试剂盒（Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit，宝生物工程大连有限公司，批号：638315）说明书将所提取总RNA进行逆转录，然后按照实时荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号：RR055A）说明书进行扩增：95℃预变性30 s；95℃扩增、延伸15 s；60℃退火30 s，共40个循环，以U6（宝生物工程大连有限公司，批号：CD200-0300）作为内参，上游引物序列：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列：AACGCTTC ACGAATTTGCGT。 miRNA-328-3p（hsa-miR-328-3pqPCR Primer，天根生物科技有限公司，批号：CD201-0349），上游引物序列：GGGGCAAGTCACTAGTGGTT，下游引物为通用引物，序列：5′CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′。本研究采用 2－ΔΔCt 相对定量方法对数据进行分析，将实验所得Ct值代入相对定量公式：ΔΔCt=（待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值）-（对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均 Ct值），以最终结果2－ΔΔCt ，进行统计学分析，以对比目的基因的mRNA水平。

采用生物信息学软件starBase[10-11] （http：//starbase.sysu.edu.cn）预测miR-328-3p的生物学功能、靶基因、基因本体（gene ontology，GO）生物学功能、京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）和PANTHER信号通路等，探讨其生物功能和可能致病机制。

1.3 观察指标及评价标准

观察并记录两组患者血浆中miR-328-3p的表达水平，并比较两组血浆中miR-328-3p表达的差异，同时，进行标志物曲线分析，采用接受者操作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲线进行分析，判断血浆循环miR-328-3p是否可作为风湿性心脏病合并心房颤动的生物标志物，ROC曲线下面积（area under curve，AUC）在>0.5 的情况下，AUC 越接近1，说明诊断效果越好，AUC在＞0.5～0.7时有较低准确性，AUC 在＞0.7～0.9时有一定准确性，AUC＞0.9时有较高准确性，AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值，AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。

1.4 统计学方法

采用 GraphPadPrism5（GraphPadSoftwareInc，CA，USA）进行数据分析，计数资料采用χ2 检验或Fisher精确检验；计量资料采用均数±标准差（

±s）表示，采用t检验；标志物曲线采用ROC曲线进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血浆循环miR-328-3p mRNA表达的比较

观察组患者的miR-328-3pmRNA表达水平为0.31±0.05，低于对照组的0.69±0.03，差异有统计学意义（P<0.01）（图1）。观察组的miR-328-3p mRNA表达水平为对照组的44.93%。

图1 两组患者血浆循环miR-328-3p mRNA表达的比较

与对照组比较，*** P<0.01

2.2 血浆循环miR-328-3p相对表达量的ROC曲线
分析

血浆miR-328-3p的AUC为0.9323，95%置信区间为 0.8598～1.0005（P<0.01）。血浆循环 miR-328-3p相对表达量的ROC曲线见图2。

图2 血浆循环miR-328-3p相对表达量的ROC曲线分析

2.3 血浆循环miR-328-3p生物信息学分析

预测结果显示，靶基因主要包括TLE1、USP37、EN2、NRIP1、FOXO4、H2AFX、UBFD1、TMEM64、PTPRF、UBE2Z等；miR-328-3p的生物学功能主要参与GO生物过程和分子功能，与心室形成、蛋白结合、细胞分裂等有关；mi-328-3p可能参与调控的KEGG和PANTHER信号通路主要包括：胰岛素受体信号通路、调控PI3K通路、调控Wnt通路（Wnt signaling pathway）等，见表1。

3 讨论

近年来，非编码RNA逐渐成为医学研究的热点，尤其以miRNA与疾病相关研究越来越受到重视。关于miRNA与心房颤动发病机制的研究尚处于起步阶段，就目前的研究来看，没有得出较为一致的结论。现有数据只能提示miRNA可能与心房颤动的发生有关，但其具体作用机制尚待研究。由于miRNA对靶基因的调控特性，可能要找到一个真正的靶点还有待深入研究。目前将miRNA作为疾病标志物的研究较为成熟，尤其在肿瘤学和心血管疾病方面[12-14] 。关于心血管疾病标志物，目前主要集中在心肌梗死，其miRNA标志物目前已经报道了很多类型，但没有一个真正可以应用于临床疾病诊治的具体标准。

表1 血浆循环miR-328-3p生物信息学分析

人类发现的miRNA多达上万种，各个miRNA的功能和作用尚未定论。其中miR-328-3P因其在多种疾病基因谱中的差异性表达脱颖而出，特别是在心血管疾病及肿瘤领域受到科研人员的广泛关注。研究显示，miR-328-3P不仅在心血管疾病的临床治疗及预后等方面有重要潜力，其异常表达也与心血管疾病的发生发展密切相关，有作为重要标志物的潜力，在心血管疾病的临床诊断、评估、治疗及预后等方面可能有重要的价值[12,15-16] 。关于miR-328-3P与心房颤动的研究目前较多，王玺等[17-19] 研究显示，房颤患者血浆miR-328-3P表达显著升高，可能参与了心房解剖重构；从而为其诊治提供新思路。Lu等[6] 研究发现，miR-328-3P通过影响L型Ca2+ 通道基因使心房发生电重构而诱导心房颤动的发生，为其发生提供了一种新型的分子机制，并将miR-328-3P视为心房颤动的潜在治疗靶点。McManus等[20]发现循环miR-328-3P通过减小L型Ca2+ 通道密度而促进电重构，与心房颤动的发生密切相关，同时提出通过调整促进心房重构的风险因素（高血压），减少miR-328-3P和心房颤动之间的关联，将miR-328-3P作为心房重构和心房颤动易患因素之一。

关于miR-328-3P风湿性心脏病合并心房颤动的研究较少。本研究对循环miR-328-3P-3p与风湿性心脏病合并心房颤动进行了一个初步研究，在较小的样本人群中显示，血浆循环miR-328-3P-3p在风湿性心脏病合并心房颤动人群中高表达，可以作为风湿性心脏病合并心房颤动人群的标志物，其具体机制还有待后续研究和大规模样本进行验证。

随着研究的深入，发现血浆或者血清中循环miRNA可以作为心房颤动发生发展的生物标志物[3，6-7] ，如循环miR-150和miR-29等，对于心血管系统疾病而言，活体组织不易获得，因此通过检测循环血中的生物标志物，对病情进行评估一直也是研究的热点，也为心房颤动和miRNA的研究提供了一个新的方向。但将血浆中或者血清中miRNA作为心房颤动标志物的研究相对较少，而且多是单中心、小样本的病例对照研究；且对于血浆、血清miRNA的产生机制、存在形式、生物学功能等尚不清楚，需要进一步深入研究。另外关于其内参的选择可能导致假阳性或者假阴性结果的出现，有研究显示，常见的内参如U6、SNORD48、SNORD44、miR-16和5S等并不一定都可以作为内参，可能对miRNA的检测产生较大影响，经过验证发现SNORD48可能为最佳内参，而U6作为内参的效果最差。因此，很多相同miRNA的研究往往不能重复，可能与内参的选择有关，在进行内参选择时，最好不要选择某一个内参，可以采用不同内参进行比较研究。

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