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高同型半胱氨酸（hyperhomocysteinemia，HHcy）与心脑血管疾病的发病密切相关[1] 。近年来的流行病学调查研究证实我国人群中HHcy总体患病率达27.5%，此类人群将面临较高的心脑血管疾病风险[2] 。糖尿病患者血浆中的HHcy浓度较正常人增高，高血糖合并HHcy更易诱发动脉内皮功能障碍，增加心血管疾病的发生[3-4] 。艾塞那肽是胰高血糖素样肽1受体激动剂（glucagon like peptide 1 receptor agonist，GLP-1 RAs），临床上主要用于2型糖尿病的治疗。艾塞那肽除具有降糖、减轻体重、改善胰岛素抵抗等作用外，还具有保护血管内皮功能作用，具体作用机制尚未完全明确[5-6] 。目前，国内外已有不少关于艾塞那肽对Hcy氧化损伤人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的作用研究，但有关炎症反应的影响未见报道。本研究拟通过体外以Hcy诱导HUVECs炎症损伤再予以艾塞那肽干预，探讨其影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

HUVECs（上海中乔新舟生物公司），艾塞那肽和HHcy（Sigma，美国），CCK-8 试剂盒（日本同仁化学研究所）；一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所），内皮素（ET）-1、白介素 6（IL-6）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）ELISA试剂（武汉华美生物工程有限公司），核转录因子-κB（NF-κB）p65 抗体和抑制蛋白 κB-α（IκBα）抗体（Abcam，美国）。

1.2 细胞培养与分组

HUVECs用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，置于37℃、含5%CO2的培养箱，每2天换液1次，当镜下细胞密度达80%左右以适量胰酶消化、完全培养基适时终止，离心后按1∶2传代。为排除血清干扰及各组细胞同步化，干预前各组换DMEM无血清培养液过夜。细胞分5组（各组设置3个复孔），具体如下。①对照组：加DMEM无血清培养基；②模型组：加含200 μmmol/L Hcy的DMEM无血清培养基； ③低剂量EXE组（EXE-L组）：加含5 nmol/L EXE的无血清 DMEM培养基预孵育2 h后加Hcy 200 μmol/L；④中剂量EXE组（EXE-M组）：含10 nmol/L EXE的无血清DMEM培养基预孵育2 h后，加200 μmol/L Hcy共培养；⑤高剂量EXE组（EXE-H组）：含20 nmol/L EXE的无血清DMEM培养基预孵育2 h后，加Hcy 200 μmol/L共培养。以上五组处理后置入细胞培养箱共培养48 h。

1.3 HUVECs生存活性检测

取对数生长期的HUVECs按1×104/孔接种于96孔板中，分组处理同前述“1.2”，把各孔原培养基吸弃后分别加入100 μl含CCK-8试剂的无血清DMEM培养基，继续在细胞培养箱孵育1 h，以酶标仪450 nm波长测定各组OD值。根据各组OD值与对照组比较作统计分析。

1.4 IL-6、ICAM-1和ET-1含量的测定

取对数生长期的HUVECs接种于96孔板中，分组处理同前述“1.2”，收集各组细胞上清液，转移于无菌 EP（1.5 ml）中，上清液按 3000 r/min（半径 r=8.4 cm）离心3 min后。用夹心法ELISA检测细胞各组上清液的IL-6、ICAM-1和ET-1含量（操作步骤按试剂盒说明进行）。

1.5 一氧化氮（NO）含量的测定

HUVECs种植于6孔板培养皿中，分组处理同前述“1.2”，吸取各组上清液，离心机 5000 r/min（r=8.4 cm）离心，5 min后收集上清液作待测样本，使用硝酸还原法进行测定（具体操作按试剂盒说明）。

1.6 蛋白免疫印迹试验检测ⅠκBα和NF-κB p65蛋白的表达

HUVECs接种于6孔板细胞培养皿中，分组处理同前述“1.2”。收集各组细胞加裂解液，低温裂解后离心取上清、蛋白定量，各组取等量样品上样，依次进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶、转膜，BSA液封闭后适当洗膜，4℃低温一抗孵育过夜后，TBST液充分洗膜，二抗孵育1 h，充分洗膜后暗室内显影，以β-actin作内参，取各组目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值作统计学分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两独立样本均数的比较采用t检验，多组样本均数间的比较采用单因素方差，方差齐使用LSD-t检验，方差不齐改用Dunnett′s T3法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理对HUVECs生存活性和NO含量的影响

模型组的细胞生存活性和NO含量显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；EXE-L 组、EXEM组和EXE-H组的细胞生存活性和NO含量显著高于模型组（P＜0.05 或 P＜0.01）（表1）。

表1 不同处理对HUVECS细胞生存活性和NO含量的比较（

±s）

与对照组比较，** P＜0.01；与模型组相比，# P＜0.05，## P＜0.01

2.2 不同处理对 HUVECs分泌 IL-6、ICAM-1和ET-1水平的影响

模型组的IL-6、ICAM-1和ET-1水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；EXE-L 组、EXEM组和EXE-H组的IL-6、ICAM-1和ET-1水平显著低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）（表2）。2.3不同处理对 HUVECs表达 IκBα 和 NF-κB p65蛋白的影响

表2 不同处理对HUVECS分泌IL-6、ICAM-1和ET-1水平的影响（

±s）

与对照组比较，** P＜0.01；与模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

模型组的IκBα蛋白表达显著低于对照组，EXE-L组、EXE-M组和EXE-H组的IκBα 蛋白表达显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01 或 P＜0.001）；模型组的NF-κB p65蛋白表达显著高于对照组，EXE-L组、EXE-M组和 EXE-H组的 IκBα 蛋白较模型组显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.001）（图 1～2）。

图1 各组HUVECs的IκBα和NF-κB p65蛋白表达免疫印迹结果

图2 各组HUVECs的IκBα和NF-κB p65蛋白表达结果的比较

与对照组比较，*** P＜0.001；与模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001

3 讨论

慢性炎症反应参与动脉粥样硬化（arteriosclerosis，AS）的发病机制已得到国内外学者的认同，最新CANTOS临床研究证实，冠心病患者在降脂基础上加用抗炎反应药物Canakinumab，比降脂治疗组更显著降低心肌梗死患者的心血管风险[7] 。Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸的主要中间代谢产物，一般以患者血浆Hcy浓度＞15 μmol/L 诊断 HHcy，本研究以 200 μmol/L浓度Hcy加速诱导血管内皮细胞损伤。有研究显示，高浓度Hcy作用于血管内皮诱发炎症反应，使主要舒张血管物质NO分泌减少，血管内皮功能失调，导致AS发生[8] 。高浓度的Hcy可使血液中白介素1β（IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）分泌增加，诱发血管内皮炎症反应与血管重构[9] ；Wang等[10] 的研究显示，在HHcy小鼠模型中，Hcy可激活炎性小体NLRP3，增加IL-1β和白介素18（IL-18）等炎症因子表达；Hcy还能促进细胞间黏附分子（ICAM-1）和E-选择素的表达，促进单核细胞向血管壁浸润，刺激平滑肌细胞过量生长，使组织纤维化和血管硬化加快，加速AS 进展[11-12] 。

炎症反应主要涉及 IL-6、IL-1β、TNF-α、ICAM-1等细胞因子，这些因子共同影响着AS的发展。TNF-α主要由单核细胞分泌，IL-6、IL-1β和ICAM-1可由动脉内皮细胞分泌，其中IL-6分泌于细胞损伤早期，是炎症反应的始动因子[13] ；ICAM-1在炎症刺激时显著增加，是血管内主要的黏附分子之一。NF-κB是调节胞内炎症信号通路的关键因子，其调控IL-6、ICAM-1等多种炎症因子的合成与分泌[14] 。IκBα是调控NF-κB的关键蛋白，正常状态下，IκBα 和 NF-κB（p65 与 p50或p52构成）结合成三聚体。外界刺激后活化IκB激酶复合体，活化的激酶复合体发生磷酸化并降解IκBα，解聚的NF-κB则向胞核转移，诱导炎症反应相关基因的转录[15] 。高糖、高脂血症、HHcy等均可激活NF-κB，活化的NF-κB促进ICAM-1和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）等表达，使白细胞趋化、黏附、聚集，诱导单核细胞浸润血管壁，使多种炎症因子释放增加，导致血管内皮细胞损伤。本研究结果显示，模型组中的IL-6和ICAM-1含量较对照组升高，IκBα 蛋白表达减少，NF-κB蛋白表达增加，提示Hcy损伤内皮细胞后，炎症反应增强。给予不同浓度艾塞那肽处理后，IL-6和ICAM-1的含量明显降低，NF-κB蛋白表达减少，而IκBα蛋白表达增加，显示炎症反应减轻，提示艾塞那肽能抑制Hcy损伤HUVECs的炎症反应，且其可能通过抑制NF-κB介导的炎症信号通路实现。

NO是由动脉血管内皮细胞合成的重要舒张血管物质，其含量高低间接反映血管内皮功能，具有扩张血管、抑制白细胞趋化、黏附和抗血小板聚集的作用，还可抑制血管平滑肌细胞增殖等抗AS的作用；ET-1也是来源于动脉内皮细胞的合成和释放，主要是收缩血管作用[17] 。NO和ET-1在正常生理状态时维持着动态平衡，一旦平衡破坏，将使血管内皮功能障碍。本研究结果显示，HHcy损伤HUVECs后，细胞上清液中ET-1含量明显升高，而NO含量下降，细胞活性降低，提示HHcy破坏了NO和ET-1之间的平衡，导致血管内皮细胞功能障碍；给予不同浓度的艾塞那肽处理后，细胞上清液的ET-1含量降低，NO含量明显上升，细胞活性增加，且具有一定的浓度依赖，提示艾塞那肽能改善HHcy诱导的内皮细胞功能失调。

糖尿病患者血管内皮受长期的高糖和脂代谢紊乱环境易诱发炎症反应，使IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子和ET-1分泌增加，NO含量减少，引起血管内皮舒张功能失调，导致AS的发生、发展[17] 。糖尿病患者由于肾小球滤过率下降和糖尿病肾病等因素使血液中的Hcy浓度排泄障碍而增高，多因素叠加使血管内皮更易受损，导致AS[3，18] ，因此，探讨早期药物干预减轻糖尿病患者的血管内皮损伤，延缓糖尿病心血管并发症的进展是值得关注的课题。本研究结果显示，艾塞那肽能抑制炎症反应保护内皮细胞的作用，可为临床上糖尿病患者选择降糖药物兼顾防治心血管并发症提供部分理论依据。

综上所述，艾塞那肽能抑制Hcy诱导HUVECs的炎症反应发挥保护作用，且该作用可能是通过抑制NF-κB介导的炎症信号通路实现的。

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