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慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonarydisease，COPD）是全球肺部疾病患者死因之一，其通过对气道的破坏，以肺实质和肺血管的慢性炎症为主要特征，呼吸道气流出现受限不完全可逆、进行性加重现象，发病率逐年上升[1]。目前对于COPD 的治疗手段尚不完善，但可在控制疾病的发生对COPD 进行预防。在患者和高危人群中寻找分子生物标志物，有助于早期筛查相关疾病[2]。研究表明，血液循环中的血清miR-125a 水平mRNA 表达，象征疾病的发生和发展阶段。血液样品在临床易于获取，mRNA 在血清及血浆中可以抵抗内源性RNA 酶而非常稳定地存在，其可在多种储存条件和反复冻融情况下保持稳定[3-4]。近年来研究表明，miR-125a 通过靶向效应器程序来稳定调节性T 细胞介导的免疫稳态[5]，COPD 是一种慢性炎症性疾病，主要涉及T 淋巴细胞浸润，而T 淋巴细胞属于机体免疫应答的重要部分[6-7]。本研究分别对COPD 患者、重度吸烟者、正常人群的外周血清miR-125a 的表达水平进行检测，旨在探究外周血清miR-125a 在患者和高危人群的早期诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月～2018年6月我院收治的50例COPD 患者作为COPD 组，另选取同期50 例正常人群作为健康对照组，50 例重度吸烟者作为重度吸烟组。健康对照组中，男28 例，女22 例；年龄20～60 岁，平均（38.61±5.26）岁。重度吸烟组中，男28 例，女22例，年龄21～61 岁，平均（38.65±5.21）岁。COPD 组中，男28 例，女22 例，年龄22～60 岁，平均（37.25±4.32）岁。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究中所有参与者均签署知情同意书，并且经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 血清采集及存放清晨釆集三组5 ml 空腹静脉血，室温下静置60 min 进行低温离心，收集上清液分装在0.6 ml 无酶管中，编号后，放于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 血清miR-125a 的mRNA 提取（TRIZOL 法）由于血清中尚无稳定及丰富表达的基因作内参，参照文献[8-9]的方法具体如下。①室温下融化血清，混匀后进行离心，将250 μl 血清转移新到新的2 ml 无酶管中之后加入20 nmol cel-mir393p（百奥斯生物科技有限公司，编号：BA0440），混匀。②加500 μl TRIZOL（Bio-Rad）（上海联硕生物科技有限公司，批号：15596026），混匀，室温静置10 min，离心10 min，取上清液体转移入新EP 管。③加200 μl 氯仿，剧烈振荡，时间为30～60 s，随后需要室温放置3 min，低温离心10 min（4℃，12 000 r/min）；小心吸取上层水相转移到干净的离心管中，加0.5 倍的无水乙醇，混匀。④过滤后吸附柱直接放入收集管中，将③步骤的液体直接转移到吸附柱中，静置大约5 min，低温离心，离心5 min（4℃，12 000 r/min）。⑤倒掉收集管中的过滤液，在吸附柱中加入500 μl PRE 溶液，稀释，静置2 min，常温离心30 s（12 000 r/min），倒掉收集管中的废液，并重复此步骤一次。⑥吸附柱合上收集管一起采用离心机低温离心2 min（4℃，12 000 r/min）。将吸附柱转移到新的无酶管中，在吸附柱中央吸附膜处直接加入无酶水40 μl（注意全部浸湿中央吸附膜），静置5 min，低温离心机离心2 min （4℃，12 000 r/min）。管中有溶解RNA 的溶液，编号后直接放入-20℃冰箱进行保存，方便开展后续试验。

1.2.3 血清miR-125a 的mRNA 逆转录本研究可在生物信息网站查得待扩增的mRNA 茎环结构的基因序列，利用Oligo 6 引物设计软件设计上下游引物（即在3′端增加碱基）。按照TaKaRa 公司的逆转录试剂盒（上海善然生物科技有限公司，批号：RR037A）说明书进行逆转录，合成cDNA。

1.2.4 实时定量PCR 法检测血清miR-125a ①应用Takara 公司的SYBR Premix Ex Taq 产品进行实时PCR 反应；②进行PCR 反应，程序如下：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s（收集荧光）；40 个循环；按照这个反应程序建立熔解曲线。以cel-mir39 作为内参，通过2-ΔΔCT 法计算目标mRNA 表达水平的差异。其中ΔΔCt=ΔCt（实验样品）-ΔCt（基准样品），ΔCt（实验样本）=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），ΔCt（基准样品）=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），2-ΔΔCt=2-（-1.2）=2.30[8-9]。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 ①细胞培养、处理：选取生长期稳定转染细胞，进行胰酶消化后，在常温状态下进行离心，并接种于孔板中，放置在温育箱内进行孵育；②实验：在光镜下对细胞进行观察，待选取细胞完全长满孔后，将直尺架于各孔板间，使用10 μl 枪头垂直于孔板底部进行划痕，3 条痕迹/孔。对各孔进行清洗，弃含有脱落细胞的清洗液。将选取细胞治愈光镜下取图拍照，每孔选择5 个固定部位，对划痕进行测量。测量完毕将孔板继续放置于温育箱内，1、2 d 后重复清洗步骤，获取划痕平均值。

1.3 观察指标

对三组血清miR-125a 的mRNA 表达水平进行评估，并观察ROC 曲线，ROC 曲线是以真阳性率为纵坐标，假阳性率为横坐标绘制的曲线，可比较不同诊断试验对疾病的识别能力。在光镜下对划痕宽度进行测量，计算细胞间距离求取均值，计算三组的创面愈合率，通过创面愈合率判断细胞的迁移能力。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清miR-125a mRNA 表达水平的比较

COPD 组血清miR-125a 的mRNA 表达水平明显低于重度吸烟组，重度吸烟组血清miR-125a 的mRNA 表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 三组血清miR-125a mRNA 表达水平的比较（

±s）

2.2 三组血清miR-125a mRNA 表达水平的ROC 曲线

重度吸烟组ROC 曲线下的面积大于COPD 组，COPD 组ROC 曲线下的面积大于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 三组血清miR-125a mRNA 的ROC 曲线

2.3 三组创面愈合率的比较

重度吸烟组、COPD 组的创面愈合率均低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 三组创面愈合率的比较[n（%）]

3 讨论

COPD 的病理机制目前尚不清楚，但研究发现引发COPD 的原因较多，常见炎症反应、氧化应激、蛋白酶抗蛋白酶失调、自身免疫失常等[10-11]。研究表明，多种疾病均可导致miR-125a 的mRNA 表达水平下降，mRNA 除可上调STAT3、IFNγ 和IL13 表达，还可打破调节性T 细胞介导的免疫平衡[12-13]。

研究表明，在COPD 患者中，吸烟导致COPD 加重的原因主要与机体氧化应激反应有关[14]，氧化应激反应可对机体气道和肺组织产生直接的损害，加速炎症反应。本研究人群中严重吸烟者的血清miR-125a的mRNA 表达水平更低。研究表明，吸烟可致氧化应激水平失调，加速炎症水平，增加疾病进展[15]。因此吸烟作为COPD 的高危因素，加速疾病进展的同时，使患者外周血清miR-125a 的mRNA 表达水平下降，其具体机制尚需要进一步的研究。

ROC 曲线是以真阳性率为纵坐标，假阳性率为横坐标绘制的曲线，可比较不同诊断试验对疾病的识别能力。本研究结果显示，重度吸烟组ROC 曲线下的面积大于COPD 组，COPD 组ROC 曲线下的面积大于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示重度吸烟组血清mRNA 的表达水平作为COPD 疾病生物标志物具有早期诊断的价值，值得临床推广应用[14-16]。划痕实验结果显示，血清miR-125a 的mRNA 表达水平越高，细胞迁移能力越快。因此miR-125a 的mRNA表达水平可作为检测COPD 患者的重要依据，但血清mRNA 可同时靶向多个基因组分，对机体各通路的调控较为复杂，要在研究中明确mRNA 与各细胞的具体发展机制和完整的靶向通路，需进一步进行深入研究。COPD 组血清miR-125a 的mRNA 表达水平明显低于重度吸烟组，重度吸烟组血清miR-125a 的mRNA 表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在进行检查中，心肌细胞内含有各种抗体组分，且COPD 患者在发病过程中，心脏功能出现明显变化，随着COPD 患者病情的加重，miR-125a 的mRNA 表达水平明显降低，进一步提示miR-125a 的mRNA 表达水平在COPD 患者诊断中的价值[17-18]。

综上所述，相对于健康人群，COPD 患者和重度吸烟高危患者中外周血清miR-125a 的mRNA 表达水平均下降，提示疾病早期存在血清miR-125a 的mRNA 表达水平异常。且吸烟可加速疾病进展，导致外周血清miR-125a 的mRNA 表达水平下降。经过ROC 曲线的敏感性和特异性分析，外周血清miR-125a 的mRNA 表达水平作为生物标志物在重度吸烟的高危患者均优于COPD 患者和健康者，提示可将血清miR-125a 作为COPD 早期诊断的生物标志物，为疾病预防和阻止进展提供依据。

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