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抗结核药物——链霉素在临床常肌内注射，不能口服给药，给患者带来不便及副作用。局部药物缓释系统是一种理想的给药方式。医用硫酸钙不仅作为药物载体而且作为填充骨缺损的修复材料已在临床上应用［1-3］。本研究中把硫酸钙链霉素制造成缓释系统颗粒植入兔子内体，观察周围肌肉组织，血液药物浓度，肝脏、肾脏组织病理学研究，为临床治疗骨结核提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用新西兰大白兔 48只，体重2.5 kg（福建医科大学动物实验中心提供）。注射用硫酸链霉素（山东鲁抗医药，规格：1 g/瓶，国药准字 H37020187）；医用硫酸钙（英国百赛公司，5CC思迪骨粉）。

1.2 缓释颗粒制作

以1 g链霉素注射粉剂与5CC医用硫酸钙粉剂，混匀倒入2 ml灭菌注射用水；混均至膏糊状（大约需30 s）。填充至3 mm×3 mm圆柱状模具中。填充时用20 N的压力加压驱赶空气，15 min固化，伸缩模具释放颗粒（图1a～1b）。颗粒电子显微镜下显示：其中以棒状结构为主，硫酸钙宽度为7.5～10.0 μm，长40～50.0 μm，链霉素以颗粒形状为主（5 μm×5 μm×5 μm）（图 1e）。

图1 颗粒的制作过程及电镜下结构

a：颗粒制备工具；b：颗粒外观；e：电镜下结构

1.3 分组及模型制作

将48只新西兰兔随机分为两组，每组24只。地西泮（1 mg/kg）耳缘静脉麻醉。单侧下肢胫骨上段手术区备皮，消毒后铺巾。以胫骨近端内侧为中心做纵行切口，长约3 em。依次切开皮肤、皮下，从肌间隙进入至胫骨内侧，剥离骨膜。骨面用电钻开槽长10 mm，宽6 mm。实验组孔内置入灭菌的颗粒4颗，含链霉素约12 mg，共48 mg。对照组植入同样份量的链霉素。放回笼内饲养并观察。

1.4 观察指标

1.4.1 血药及组织浓度检测于术后 1、2、3 d，1、2、4、6、8、10周，取耳缘静脉血1～2 ml待检；在孔半径5 mm处取0.5 mg大小组织4块，分别粉碎后加5 ml PBS匀浆，400 r/min离心15 min，留取上清液-20℃冻存待检。HPLC法测定链霉素浓度。

1.4.2 组织相容性测定术后2、6周，取植入部位、肝、肾脏组织，制成病理切片，HE染色，光学显微镜观察。术后 2、6 周抽血，行肝［丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）］、肾功能［肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）］检查。

1.4.3 成骨性检测术后1、2、4、8周行植入部位X射线检查，了解成骨情况；术后8周植入部位取材，制成病理切片，光镜检查成骨情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

兔麻醉清醒后，觅食水正常。实验组死亡2只，对照组死亡1只，为保证数据的准确性，及时补充动物。死亡原因是患肢骨折后导致伤口感染。其余动物顺利完成本实验，生长平稳，伤口均能达到愈合。

2.2 药物代谢曲线

实验组中链霉素在周围组织维持9周最低杀菌浓度（MBC），植入10周尚处于最低抑菌浓度（MIC）；静脉血液中可维持8周MBC，植入9周尚处于MIC。对照组链霉素在周围组织维持2周MBC，植入3周处于MIC；在血液维持1周MBC，植入2周处于MIC。两组血液和组织的药物浓度持续时间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图 2）。

图2 两组血液和组织的药物浓度代谢曲线

a：实验组血药链霉素浓度术后峰值在3周，MBC维持8周；b：实验组组织链霉素浓度术后峰值在2周，MBC维持9周；e：对照组血液链霉素浓度术后MBC维持1周；d：对照组组织链霉素浓度术后MBC维持2周

2.3 组织相容性测定

术后肝肾组织取病理检查提示，术后早期2周、术后晚期6周细胞形态良好，肾小球、肾小管，肝组织汇管区，巨噬细胞、肝细胞形态正常。肝肾无器质性改变。

2.4 药物安全性检测

两组术前的肝、肾功能指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组术后 2、6 周的肝、肾功能指标分别与术前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组术后2、6周的肝、肾功能指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组术前、术后肝功能、肾功能指标的比较（

±s）

2.5 成骨性检测

实验兔术后1、2、4、8周行植入部位X射线检查，颗粒逐渐缓释，消失。局部出现诱导成骨。术后8周实验兔植入部位取材，制成病理切片，可见骨细胞长入，内含毛细血管，中性粒细胞（图3）。

图3 术后兔子下肢X线片及组织病理片

a：术后1周提示X线示缓释颗粒清晰可见；b：术后2周颗粒可见，稍变模糊；e：术后4周X线显示颗粒模糊，已经崩解，呈细小微粒；d：术后8周X线显示颗粒模糊，已经诱导成骨；e：术后8周实验组局部组织病理切片（HE，40×）显示骨细胞长入，内含毛细血管，中性粒细胞

3 讨论

近年结核发病有所增加。骨结核好发于脊柱、股骨远端、胫骨近端及膝关节。如果诊治不及时或不规范，极易造成关节毁损或椎体破坏、甚至累及椎管，压迫脊髓神经，造成瘫痪［4-5］。脊柱的椎体的上下椎板、股骨远端、胫骨近端等部位主要由骨细胞软骨细胞、致密胶原及糖蛋白基质共同构成，自身修复困难。同时病灶周围坏死硬化的骨具有屏障作用，导致局部药物浓度过低或者不能达到病灶［3，6］。链霉素长期使用可导致肾、耳毒性。注射部位感染、硬结、肌肉挛缩。病灶局部搭载含链霉素缓释药物人工骨支架植入是当前理想的解决策略［7-11］。医用硫酸钙是一种良好的骨修复填充材料，被广泛应用于口腔科和矫形外科［12-13］。文献报道［14-18］，硫酸钙具备诸多理想的骨移植替代材料的特点：①在生物体内完全吸收；②较好的生物相容性、可成形性；③为新骨生长提供支架，填补骨缺损；诱导成骨；④自然界含量丰富。我院曾尝试将链霉素和硫酸钙做成缓释系统应用于脊柱结核的治疗，取得了预期的疗效［19-20］。

实验药物代谢曲线显示，组织内的链霉素可在体内持续释放，能够维持局部有效治疗的药物浓度。链霉素可维持高于10倍结核分枝杆菌的MIC，长达10周。文献报道抗结核药物一般MBC为MIC的10倍。链霉素的MIC为0.05 μg/ml。该颗粒在动物体内2周左右出现崩解，药物累计释放量突然增加，药物浓度达到高峰，而后逐渐降低，表明存在突释现象。药物的突释也是药物工作者共同存在的问题。资料显示，药物突释的定义3 d内释放量比例不超过总量的40%［21］。本缓释颗粒3 d时累计释放量30%，在药物突释的范围内。同时电镜下结构显示，链霉素与硫酸钙棒状的分子结构，分子间相互交错成形，达到后续的缓慢释放作用。

本研究中，实验的血药浓度数据显示，实验组在9周内均可检测到高于10倍结核分枝杆菌的MIC，已经达到抗结核治疗的目的；实验药物代谢曲线显示，局部组织的药物浓度均高于同期的血液药物浓度，且能够长时间维持结核分枝杆菌的MIC；组织相容性测定数据显示，在实验的术后早期2周时、术后晚期6周的肝肾组织病理学检查，肝肾组织细胞形态正常，均无器质性改变；药物的安全性数据显示，通过肝肾功能检查分析，术前、术后指标均无明显升高，差异无统计学意义（P＞0.05），提示该血药浓度并无急性、慢性肝肾功能损伤。本研究中，术后影像学检查显示，术后1周颗粒清晰可见，术后2周左右颗粒开始模糊，提示颗粒开始出现崩解，术后4周时颗粒已经变得完全模糊，成云雾状，提示时期颗粒已经完全崩解成细微颗粒，术后8周时颗粒已经消失，逐渐出血骨痂形成，提示硫酸钙已经开始诱导成骨；术后病理检查提示骨缺损处发生炎症反应，见炎症细胞、中性粒细胞长入、浸润，毛细血管增殖，为成骨细胞快速分化，逐渐形成新骨骨痂。

将抗结核药链霉素-硫酸钙颗粒在兔子体内实验显示，药物代谢能够保证有效浓度的情况下，无肝肾毒性。仍然存在不足，如药物存在一定的突释现象，缓释颗粒的强度不够，容易破碎。下一步解决方案在后续研究中进一步改进。

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