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肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）主要见于肺移植和体外循环手术的早期，是导致术后呼吸功能障碍及死亡的重要原因[1-2],因此有必要探讨其有效的防治措施。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有多向分化能力的干细胞，体外易于迅速扩增，短期内便能得到治疗所需细胞量，可促进损伤组织修复，是细胞替代治疗的重要组成部分[3-4]。研究显示，BMSCs对小鼠肾缺血再灌注损伤有保护作用[5-6]，但其对LIRI的影响有待探讨。本研究旨在探讨BMSCs对小鼠LIRI的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 实验动物

健康雄性C57BL/6J小鼠70只，购买于武汉大学动物实验中心[SCXK（鄂）2015-0025]，6～8 周龄，体重16～24 g。健康SD大鼠5只，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2012-0001]，4周龄，体重98～105 g。实验过程中对实验动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 主要仪器和试剂

呼吸机：瑞世康医疗器械有限公司；低速高速离心机：上海安亭仪器有限公司；光学显微镜：Olympus公司；M200酶标仪：TECAN；流式细胞仪：北京达科为生物技术有限公司；ELISA试剂盒：南京建成科技有限公司；胎牛血清：美国gibco公司；高糖DMEM：美国gibco公司；双抗：上海泽迈生物技术有限公司；胰蛋白酶：康为世纪生物有限公司；PBS缓冲液：美国gibco公司；

1.3 实验分组和处理

采用随机数字表法，将小鼠分为7组（n=10），包括假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、BMSCs 1 组（尾静脉注射 1×106个 BMSCs）、BMSCs 2 组（尾静脉注射2×106个BMSCs）、BMSCs 5组（尾静脉注射5×106个 BMSCs）、BMSCs 10 组（尾静脉注射 10×106个BMSCs）、BMSCs it组（气管内注射 5×106个 BMSCs）。

根据文献[7]介绍的方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞。大鼠脱臼处死后，用体积分数为75%的乙醇全身浸泡消毒10 min。无菌条件分离双下肢，磷酸盐缓冲液清洗3次。将股骨和胫骨的骨骺端剪掉，暴露出骨髓腔，用添加青、链霉素的培养基冲出骨髓，制成单细胞悬液，离心弃上清，重悬沉淀以1.0×109/L的细胞浓度接种于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养。24 h首次半量换液，48 h后全量更换培养基，以后每3天全量更换新鲜培养基。待贴壁细胞达70%～80%融合时，用0.25%胰酶消化3～5 min，按1︰2的比例进行传代培养。收获第3代生长状态良好骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，流式细胞仪进行检测分析骨髓间充质干细胞表面标志物。

参照文献[8]介绍的方法制备肺缺血再灌注损伤模型。小鼠腹腔注射0.1 mg/g氯胺酮＋0.01 mg/g甲苯噻嗪进行麻醉，气管切开后，气管插管机械通气，潮气量 0.6 ml，通气频率 120 次/min，吸呼比 1∶2，吸入氧浓度100%。左胸部去毛，消毒局部皮肤，钝性分离第4、5肋间隙，充分暴露左侧肺门，经尾静脉注射肝素5 U/g，5 min后用血管钳于呼气末阻断左侧肺门，使左肺缺血60 min即为缺血期，然后移除血管钳解除阻断，再灌注左肺240 min形成再灌注期。再灌注的同时,I/R组经尾静脉注射磷酸盐缓冲液0.5 ml,BMSCs 1组经尾静注射1×106个BMSCs,BMSCs 2组经尾静脉注射2×106个 BMSCs,BMSCs 5 组经尾静脉注 5×106个BMSCs,BMSCs 10组经尾静脉注射10×106个BMSCs,BMSCs it组经气管内注射5×106个BMSCs。实验过程中持续经静脉输注生理盐水450 μl/h，并维持直肠温37～38℃，Sham组只开胸。于再灌注结束时抽取小鼠股动脉血，进行血气分析，并计算氧合指数（PaO2/FiO2）。

1.4 观察指标及检测方法

放血处死小鼠，取左下肺组织，称重后，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成10%组织匀浆，4℃离心取上清液，采用酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定SOD、IL-8、TNF-α、MPO 的含量。

取左下肺组织，10%甲醛溶液固定、常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察各组标本组织学改变。在400倍视野下随机选择10个非重叠视野，参照文献[9]进行病理学损伤评分，取其平均值。1分：肺组织结构正常；2分：肺间质轻度充血和中性粒细胞轻度浸润；3分：血管周围水肿形成，肺组织结构部分破坏，中性粒细胞中度浸润；4分：肺组织结构严重破坏，大量中性粒细胞浸润。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，采用多样本 t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 七组小鼠PaO2/FiO2和肺组织病理学损伤评分的比较

与Sham组比较，I/R组、BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5 组、BMSCs 10 组、BMSCs it组的 PaO2/FiO2降低，肺组织病理学损伤评分升高（P＜0.05）。与I/R组比较，BMSCs 1 组、BMSCs 2 组、BMSCs 5 组、BMSCs 10组、BMSCs it组的PaO2/FiO2升高，肺组织病理学损伤评分降低（P＜0.05）。 BMSCs 1 组、BMSCs 2 组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的上述指标比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 七组小鼠PaO2/FiO2和肺组织病理学损伤评分的比较（

±s）

与 Sham 组比较，*P＜0.05；与 I/R 组比较，#P＜0.05

2.2 七组小鼠肺组织各测定指标水平的比较

与Sham组比较，I/R组、BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的SOD降低，MPO、IL-8、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。与 I/R 组比较，BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的 SOD 升高，MPO、IL-8、TNF-α 降低（P＜0.05）。BMSCs 1组、BMSCs 2组、BMSCs 5组、BMSCs 10组、BMSCs it组的上述指标比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

表2 七组小鼠肺组织各测定指标水平的比较（

±s）

与 Sham 组比较，*P＜0.05；与 I/R 组比较，#P＜0.05

3 讨论

本研究参照文献[8]介绍的方法采用夹闭小鼠左侧肺门（包括气管、肺动脉、肺静脉）60 min，再灌240 min制备小鼠肺缺血再灌注损伤模型。结果显示，与Sham组比较，I/R组的PaO2/FiO2降低，光镜下和电镜下均可见病理改变，肺组织病理学损伤评分升高，提示模型制备成功。

参照文献[7]介绍了全骨髓培养法分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞。本研究选择在再灌注的同时，I/R组经尾静脉注射磷酸盐缓冲液0.5 ml，BMSCs 1组经尾静注射1×106个 BMSCs，BMSCs 2组经尾静脉注射 2×106个 BMSCs，BMSCs 5组经尾静脉注射5×106个 BMSCs，BMSCs 10 组经尾静脉注射 10×106个 BMSCs，BMSCs it组经气管内注 5×106个 BMSCs。结果显示，与I/R组比较，不同浓度BMSCs组的PaO2/FiO2升高，肺组织病理学损伤评分降低，且呈量效关系，提示注射BMSCs可减轻小鼠肺缺血再灌注损伤。

LIRI发生机制十分复杂，尚未完全阐明，目前研究认为，可能与氧自由基引起的氧化损伤密切相关[10-12]。生理状态下，体内氧自由基的生成和清除处于动态平衡，但在LIRI时通过吞噬细胞系统、线粒体呼吸链等途径释放大量氧自由基。氧自由基是器官缺血再灌注后致组织损伤最早、最重要的有害物质之一[13]。SOD为机体中清除自由基的酶，可清除氧自由基，其活性代表了组织抗氧化损伤的能力。本研究结果显示，与I/R组比较，经尾静脉和气管内注射不同浓度BMSCs组的SOD水平升高，提示注射BMSCs可通过清除氧自由基，减轻小鼠肺缺血再灌注损伤。

中性粒细胞浸润是导致LIRI的重要原因之一[14-17]。活化的中性粒细胞通过脱颗粒释放MPO和其他蛋白水解酶及炎症介质，导致肺泡毛细血管膜损伤，发生渗透性肺水肿，出现肺弥散功能障碍[18]。通常情况下中性粒细胞是在炎症介质的趋化下迁移到肺组织中[19]。TNF-α及IL-8是中性粒细胞主要的趋化因子[20-21]。本研究结果显示，与I/R组比较，经尾静脉和气管内注射不同浓度 BMSCs组的 MPO、TNF-α、IL-8的水平降低，提示注射BMSCs可通过抑制肺组织炎性反应，减轻小鼠肺缺血再灌注损伤。

综上所述，经尾静脉和气管注射BMSCs可减轻小鼠肺缺血再灌注损伤，其机制与清除氧自由基和抑制肺组织的炎症反应有关。

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