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慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以进行性气流受限为特点的炎症反应性疾病[1]。吸烟是导致COPD发生的重要因素，香烟烟雾成分能刺激活性氧显著增加并诱导炎症反应[2]。除了肺部异常外，骨骼肌萎缩是最常见的肺外组织改变[3]。前期研究显示，COPD大鼠肌肉生长抑制素（myostatin）含量显著增加，能够促进肌肉萎缩，而骨骼肌萎缩的发生可能与COPD肺部炎症及全身性炎症反应有关[4]。笔者推测香烟烟雾成分升高骨骼肌细胞myostatin含量，引起炎症反应，导致骨骼肌萎缩和功能障碍。本研究采用香烟烟雾处理小鼠C2C12成肌细胞，观察myostatin表达和炎症反应情况，并探讨myostatin在骨骼肌炎症反应中的作用，为COPD骨骼肌萎缩的防治提供新的思路和实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠成肌细胞C2C12细胞（中科院上海细胞库），芙蓉牌香烟（焦油12 mg/支）（湖南中烟工业有限责任公司），DMEM培养基和胎牛血清（Gibco），MTT试剂（Sigma），Lipofectamine 3000和TRIzol（Invitrogen），逆转录试剂盒和Real-time PCR检测试剂盒（Takara），BCA蛋白定量试剂盒（WellBiology），ECL发光液（Pierce），兔抗myostatin多克隆抗体（Proteintech），GAPDH抗体、IL-8和TNF-α ELISA 试剂盒（博士德），myostatin siRNA（GCGGATGGCAAGCCCAAATT，吉玛生物）。

1.2 方法

1.2.1 香烟烟雾提取物制备参照文献方法并加以改良[5]。将1支芙蓉牌香烟去滤嘴燃烧5 min的烟雾通过注射器连续抽吸溶于10 ml 37℃预热的DMEM中，过滤除菌后作为100%的CSE原液，分别配置1.0%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE工作液，1 h内用于实验。

1.2.2 MTT检测以5000个细胞/孔接种于96孔板，分别给予0.1%、2.5%、5.0%和10.0%的CSE处理48 h，每组6个复孔，依照MTT说明书进行操作，检测不同浓度CSE处理后C2C12细胞生长情况。

1.2.3 细胞干预和分组以105个细胞/孔接种于24孔板，实验分为4个组，分别为对照组、5%CSE组、myostatin-siRNA组、5%CSE＋myostatin-siRNA组。处理48 h，每组6个复孔，收集细胞上清用于ELISA分析，收集细胞用于mRNA或蛋白表达分析。

1.2.4 Real-time PCR检测 C2C12细胞按照TRIzol法提取总RNA，依照试剂盒操作逆转成cDNA。使用ABI7500实时荧光定量PCR进行PCR扩增，引物序列见表 1。反应体系 20 μl，扩增条件为 95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共 40 个循环。按照 2-ΔΔCT法[6]计算各组myostatin的相对表达量。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot检测 C2C12细胞按照RIPA裂解法提取总蛋白，BCA试剂盒定量后取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭 1 h，分别以 myostatin 抗体（1∶1000）和GAPDH抗体（1∶1000）孵育过夜后，二抗（1∶5000）孵育 1 h，ECL化学发光显影。

1.2.6 ELISA检测 C2C12细胞上清收集后，通过ELISA方法测定IL-8和TNF-α含量，具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较选用最小显著性差异法（LSD），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度CSE对小鼠C2C12细胞增殖的影响

CSE处理小鼠C2C12细胞48 h，与对照组吸光值1.21±0.13相比，1.0%和2.5%CSE组平均吸光度值为1.15±0.09和1.11±0.15，无明显变化，细胞增殖无明显影响（P＞0.05）；5%和10%CSE 平均吸光度均为 0.92±0.17，明显降低，细胞增殖被明显抑制（P＜0.05）（图1）。后续实验选用5%CSE进行处理。

图1 不同浓度的CSE对小鼠C2C12细胞增殖的影响

与 Control比较，★P＜0.05

2.2 各组细胞myostatin mRNA的表达水平分析

Real-time PCR检测结果显示，5%CSE组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为1.32±0.15，显著高于对照组的 1.00（P＜0.05）；myostatin-siRNA 组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为0.61±0.19，低于对照组（P＜0.05）；5%CSE＋myostatin-siRNA组的C2C12细胞myostatin mRNA表达水平为0.92±0.13，低于 5%CSE 组（P＜0.05）（图 2）。

图2 不同处理对小鼠C2C12细胞myostatin mRNA表达水平的影响

与 Control比较，★P＜0.05；与 5%CSE 比较，#P＜0.05

2.3 各组细胞myostatin蛋白的表达水平分析

Western blot检测结果显示，5%CSE组的C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为1.40±0.11，显著高于对照组的 1.00（P＜0.05），myostatin-siRNA 组的 C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为0.52±0.17，低于对照组（P＜0.05），5%CSE＋myostatin-siRNA 组的 C2C12细胞myostatin蛋白表达水平为0.93±0.15，低于5%CSE 组（P＜0.05）（图 3）。

图3 不同处理对小鼠C2C12细胞myostatin蛋白表达水平的影响

与 Control比较，★P＜0.05；与 5%CSE 比较，#P＜0.05

2.4 各组细胞炎症介质表达水平

ELISA检测结果显示，5%CSE组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量分别为835.83±47.30和218.83±27.09，显著高于对照组（P＜0.05）；myostatinsiRNA组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量分别为 510.17±49.15和110.67±12.60，与对照组比较差异无统计学意义（P＜0.05）；5%CSE＋myostatin-siRNA组C2C12细胞上清中的IL-8和TNF-α含量分别为 709.83±111.75与 162.17±23.52，低于 5%CSE 组（P＜0.05）（图 4）。

图4 不同处理对小鼠C2C12细胞炎症介质表达水平的影响

与 Control比较，★P＜0.05；与 5%CSE 比较，#P＜0.05

3 讨论

目前，COPD已经成为全球第四大致死性疾病，每年受COPD困扰的患者多达6亿。全球30岁以上人群中，COPD的患病率从1990年的10.7%上升到2010年的11.7%[7]。2013年全球疾病负担（GBD 2013）报告指出，COPD导致的死亡人数从1990年的242.13万上升至2013年的293.12万，约占全球死亡人数的6%,成为全球第三大致死性疾病[8]。在发达国家，COPD是增长最为迅速的死因之一，在心脑血管疾病病死率大幅下降的同时，COPD的死亡率却增加了163%[9]。随着发展中国家吸烟率的增加和高收入国家的老龄化，COPD的发病率预计在未来30年内将上升，预计到2030年将有超过450万人死于COPD和相关疾病，死亡人数将接近全球死亡总数的8.5%，成为全球第3位死因疾病。近年来，我国COPD发病率呈上升趋势。《中国居民营养与慢性病状况报告（2015年）》指出，我国40岁及以上人群中COPD患病率为9.9%。张荣葆等[10]针对中国已发表的19项COPD大型流行病学调查资料（2000年1月～2011年12月）分析后，发现中国各地40岁以上人群COPD患病率为6.0%～15.4%。

吸烟是COPD发生、发展过程中最重要的危险因素，香烟烟雾成分能导致肺部乃至全身异常的炎症反应，引起肺癌组织如骨骼肌、心血管等病变，加重COPD的进展[11]。骨骼肌是COPD受累最主要的肺外组织，研究显示，吸烟能导致蛋白合成减少和降解增多，从而导致骨骼肌消耗[12]。此外，香烟烟雾成分能使肺部产生过多的炎症介质（如IL-8和TNF-α）并释放到循环中，参与骨骼肌萎缩的发生[13]。在骨骼肌的消耗及功能障碍过程中，肌肉生长抑制素受到广泛关注，其主要作用为抑制肌肉的生长发育，在肌肉消耗性疾病中表达增高[14]。前期研究已证实，COPD大鼠myostatin含量显著增加，而其在骨骼肌炎症中的作用如何尚未查见相关文献报道。

本研究结果显示，CSE处理小鼠成肌细胞C2C12后细胞myostatin表达增加，炎症介质释放增多；而用myostatin-siRNA沉默myostatin基因后再用CSE处理细胞，myostatin表达增加程度受到抑制，炎症介质释放减少。这提示CSE处理能诱导myostatin表达，沉默myostatin基因后，CSE促进炎症介质释放的作用受到限制，而单纯的myostatin基因沉默并不影响细胞炎症介质的释放，提示myostatin并不直接参与炎症反应的上游调控，而在CSE刺激后，抑制myostatin能够反馈性的减少CSE所致的炎症反应，因此，CSE可导致myostatin水平升高，骨骼肌消耗和萎缩，炎症反应加重，与COPD呈正相关。myostatin沉默后，骨骼肌消耗和萎缩减少，能够对抗CSE所致的炎症反应，缓解COPD[15]。香烟烟雾成分诱导炎症介质产生后，可以通过促进蛋白分解和抑制蛋白合成来诱导骨骼肌消耗[16]，同时活化p38和ERK的MAPK信号，应用p38和ERK的抑制剂能够消除肌肉萎缩和肌球蛋白降解[17]，而吸烟者肌肉蛋白合成降低主要与myostatin表达增加有关，myostatin通过抑制Akt的活化，阻碍蛋白合成的启动和细胞更新而抑制肌肉生长[18]，同时香烟烟雾成分能减低肌肉中活化的Akt，并损害肌肉细胞的分化能力[19]。早期研究显示，COPD患者的运动功能受限主要归因于其肺功能受损，而近年来的研究发现，许多肺功能受损不明显的患者也存在运动功能异常[20]，而干预myostatin来改善骨骼肌功能障碍对于更好地防治COPD炎症反应和疾病演变，改善预后，提高生活质量可能有着重要的价值。

综上所述，通过小鼠C2C12成肌细胞体外培养模型，观察香烟烟雾提取物对myostatin表达和炎症反应的影响，并通过沉默myostatin表达观察炎症反应的改变，并将myostatin作为研究重点，为COPD骨骼肌萎缩和炎症反应的防治提供新的思路和实验依据。

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