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念珠菌感染病机特点为本虚标实，邪盛正衰[1]。补中益气汤为宋代李杲《内外伤辨惑论》之方剂，具有补中益气、升阳举陷之功，是临床上治疗脾虚证的经典方剂[2]。研究表明，补中益气汤可提高脾气虚动物模型免疫器官指数，有助于提高免疫功能[3]。念珠菌感染容易发展为多器官功能不全综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），其中肝脏是最常见的受损器官之一[4]。线粒体结构和功能的改变参与了脓毒症发生、发展的过程[5]。本研究主要探讨补中益气汤对念珠菌感染动物模型肝脏线粒体的保护作用和可能机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

昆明小鼠共40只（雄性，体重 20～25 g），由中山大学实验动物中心提供[6][SCXK（粤）2009-0011]。实验开始前2 d予环磷酰胺预处理，剂量分别为200 mg/kg、100 mg/kg；实验开始后第4天予环磷酰胺200 mg/kg。白念珠菌（ATCC90028，沙保弱培养基37℃培养48 h）配制标准混悬液（1×109cfu/ml），采用腹腔注射白念珠菌混悬液方法建立念珠菌感染动物模型。

1.2 主要仪器与试剂

参照2010年《中华人民共和国药典》，中药复方包括黄芪 30 g，升麻 6 g，柴胡6 g，边条参10 g，炙甘草15 g，当归6 g，橘皮6 g，白术10 g。所有药材均购自广州市药材市场，经鉴定为正品。生药加适量水浸泡 0.5～1.0 h，煎煮 2 次（1.5、1.0 h），合并滤液，然后将药物浓缩至生药1 g/ml，4℃保存以备用。

1.3 实验分组及处理[6]

雄性昆明小鼠40只随机分为对照组和试验组，每组20只。对照组和试验组均给与抗真菌药物灌胃治疗[伊曲康唑口服液（西安杨森），50 mg/kg，q12 h，稀释成1 ml溶液]。试验组同时给予补中益气汤 4 g/（kg·d）灌胃。对照组给予等量生理盐水灌胃。取0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm肾组织匀浆，沙保弱培养基37℃培养48 h，进行白念珠菌菌落计数。动物模型建立后第7天处死实验动物。组织标本采集后储存于-80℃冰箱中。

1.4 观察指标及检测方法

实验第7天记录两组生存例数，计算生存率。RT-PCR检测PGC-1α mRNA表达丰度。ELASA（南京建成生物工程研究所）检测氮化应激指标（NO、总NOS、iNOS）。取肝脏组织 0.2 cm×0.2 cm×0.3 cm，固定后切片，光镜观察肝脏形态学变化。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，采用 t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠生存率的比较

试验组第7天小鼠生存率为70%，显著高于对照组的30%，差异有统计学意义（P=0.011）。

2.2 两组小鼠PGC-1α和氮化应激指标的比较

试验组小鼠PGC-1α mRNA显著高于对照组（P＜0.05）；试验组小鼠氮化应激指标显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 两组小鼠PGC-1α和氮化应激指标的比较（

±s）

2.3 两组小鼠光镜病理的比较

对照组小鼠光镜下可见肝窦充血、细胞肿胀、部分呈空泡样改变，局部可见少量白细胞移行。试验组肝窦充血、细胞肿胀较对照组减轻，空泡样改变较对照组减轻（图1）。

图1 两组小鼠的肝脏光镜

A：对照组（20×）；B：对照组（40×）；C：试验组（20×）；D：试验组（40×）

3 讨论

近年来，念珠菌感染已占院内感染的13.2%，越来越受到临床重视[7]。本研究前期研究显示，免疫功能低下参与念珠菌感染的发生和发展，提高免疫功能可以改善念珠菌感染小鼠7 d生存率。免疫防御是西医范畴中对机体抵抗微生物侵袭这一重要生理功能的描述。在中医范畴中，将这一生理功能表述为正气防御外邪。卫气是肺、脾、肾功能协调旺盛的结果，可以发挥正气防御外邪的作用。中医学认为，卫气与肾、脾、肺有关，关键又在于脾[8]。

中医学认为，中医脾与淋巴免疫功能密切相关[9]。《脾胃论》指出“内伤脾胃，百病由生”。脾不仅主运化水谷精微，为后天之本，且能行使防御机能[1]。念珠菌感染多因年老、久病、长期卧床、外伤等原因致肺脾亏虚，痰湿、痰热等外邪乖虚而入，肺失宣降、脾失健运发所致[2]。故念珠菌感染病机特点为本虚标实，邪盛正衰。补中益气汤为宋代李杲《内外伤辨惑论》之方剂，具有补中益气、升阳举陷之功，是临床上治疗脾虚证的经典方剂。研究表明，补中益气汤可提高脾气虚动物模型免疫器官指数，有助于提高免疫功能[3]。

念珠菌感染容易并发多器官功能不全综合征，其中肝脏是重要的靶器官[10]。线粒体结构和功能的改变参与了脓毒症发生、发展的过程[11]。脓毒症早期，肝细胞线粒体即可出现结构和功能改变，是脓毒症发展的重要启动环节；脓毒症恢复期，线粒体损伤伴随着新的线粒体蛋白的生成，是参与脓毒症机体修复过程的重要表现[12]。

目前针对补中益气汤治疗脾虚动物模型的研究仅限于T淋巴细胞增殖能力和脾淋巴细胞抗氧化损伤[13]。本研究前期研究证实，免疫调节剂减轻念珠菌感染所致肝损伤与保持肝脏线粒体的完整性有关，但补中益气汤对念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护机制未明[14]。本研究中，试验组PGC-1α mRNA显著高于对照组，提示补中益气汤可以通过促进念珠菌感染动物模型肝细胞线粒体生成发挥对肝细胞线粒体的保护作用。既往研究证实，蛋白酶抑制剂可以提高PGC-1α水平，并且呈剂量依赖性，提示肝细胞线粒体生物发生参与了念珠菌感染病理损害的过程。

线粒体结构和功能损伤是脓毒症器官功能损害的重要机制，大量动物研究结果显示细胞因子的级联反应是线粒体结构和功能损伤的主要原因之一[15-16]。细胞因子风暴包括氧化应激和氮化应激。近来多项基础研究显示氮化应激参与了脓毒症线粒体结构和功能损伤的全过程[17-18]。本研究中，试验组氮化应激指标显著低于对照组，提示补中益气汤可以通过抑制氮化应激水平促进念珠菌感染动物模型肝细胞线粒体生物发生，降低氮化应激程度与肝细胞保护作用相关。补中益气汤与氮化应激、肝细胞线粒体生物发生之间的量效关系尚待进一步的探索研究。

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