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肛瘘是肛管直肠与肛门周围皮肤相连通的一种病理通道，是肛周脓肿的慢化阶段，其临床表现特点主要为肛门硬结、压痛、反复局部流脓、潮湿及瘙痒。紫草油多年临床验证它能促进创面愈合，然其作用机制不明。TGF-β1/Smad3信号转导通路在创面修复过程扮演着重要的角色。所以为阐明紫草油的作用机制，本实验以TGF-β1和Smad3因子为研究对象，检测TGF-β1和Smad3因子表达水平的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2017年3月～2018年3月收治的90例肛瘘患者作为研究对象，均签署知情同意书。本研究已经医院医学伦理委员会审核批准。按照简单随机方法分为紫草油组（30例）、肤痔清组（30例）与凡士林组（30例）。紫草油组中，男19例，女11例；平均年龄（45.22±11.01）岁。肤痔清组中，男 17 例，女 13 例；平均年龄（43.02±10.21）岁。凡士林组中，男 18 例，女 12例；平均年龄（44.62±09.51）岁。三组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性

1.2 诊断及入选标准

按照2006年出版的《肛瘘临床诊治指南（2006版）》[1]，选取低位单纯性肛瘘作为研究对象。所有病例均在局麻下行“肛瘘切开术”。

1.3 研究方法

1.3.1 血清的提取各实验组于手术后第1、7、14、21天次日抽取外周静脉血3～5 ml，离心机离心后吸取上层血清至1.5 ml EP管保存。

1.3.2 RT-PCR法按试剂盒操作程序提取总RNA并检测，之后进行RT-PCR实验。目的基因引物：TGF-β1上游引物序列为5′-AAGGACCTGGGTTGGAAGTG-3′，下游引物序列为5′-CCGCTTCCTTTGTCCATCAG-3′（扩增产物长度：381 bp）。 Smad3基因的上游引物序列为 5′-AGTTTGACGGTGAGCTGGTA-3′，下游引物序列为 5′-GCCTCGGCCTGCCGCAAGCCT-3′（扩增产物长度：364 bp）。内参GAPDH序列为：上游5′-CACCGGGAAACCCATCACCA-3′，下游为 5′-ACGCC AGTAGACTCCACGACAT-3′（扩增产物长度：96 bp）。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldViewTM染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

1.3.3 Western-blot法裂解液提取总蛋白后取等量总蛋白。电泳分离后用PVDF膜进行转膜。将TGF-β1和Smad3一抗用封闭液稀释1000倍；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反应过夜。然后将二抗用1×TBST稀释3000倍，将一抗反应膜放入二抗中作用60 min。ECL试剂盒显色，拍照，采用美国UVP分析仪器，对胶片进行扫描，比较各组灰度变化

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，两样本之间采用t检验，多样本比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β1和Smad3 mRNA在血清中的表达

TGF-β1及Smad3 PCR扩增曲线显示，每条曲线均有明显的指数扩增期，表明PCR体系完好；TGF-β1及Smad3 PCR产物的溶解曲线显示各扩增产物为特异性目的基因（图1～2）。

图1 TGF-β1PCR反应的扩增及溶解曲线

图2 Smad3 PCR反应的扩增及溶解曲线

2.2 三组术后不同时间TGF-β1和Smad3 mRNA相对表达水平的比较

经治疗，肛瘘术后三组TGF-β1mRNA的表达水平均有所升高。术后第21天紫草油组中的TGF-β1 mRNA表达高于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05）；同时术后第21天，紫草油组中的Smad3 mRNA表达低于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05）（表 1）。

2.3 紫草油治疗肛瘘术后TGF-β1、Smad3蛋白表达水平的影响

术后第21天，紫草油组TGF-β1蛋白表达水平明显高于凡士林组、肤痔清组，差异有统计学意义（P<0.05）。与之相反，Smad3蛋白表达水平明显低于凡士林组、肤痔清组，差异有统计学意义（P<0.05）（图3、表2）。

表1 三组术后不同时间TGF-β1和Smad3 mRNA相对表达水平的比较（ng/L，

±s）

与肤痔清组同时间比较，*P＜0.05；与凡士林组同时间比较，#P＜0.05

图3 紫草油治疗肛瘘术后TGF-β1、Smad3蛋白表达结果

表2 三组TGF-β1和Smad3蛋白相对水平的比较（ng/L，

±s）

与肤痔清组同时间比较，*P＜0.05；与凡士林组同时间比较，#P＜0.05

2.4 三组病例创面愈合时间的比较

紫草油组的创面愈合时间短于肤痔清组及凡士林组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 3）。

表3 三组病例创面愈合时间的比较（d，

±s）

3 讨论

肛瘘是肛肠科常见疾病。肛瘘亦称为肛管直肠瘘，是一种异常管道[2]。国外有学者[3]报道，每十万人口有86人罹患肛瘘，平均年龄38．3岁，男女比例为1.8∶1.0，年龄＜15岁的患者多为男性。手术是肛瘘的主要治疗方法，但由于特殊的病变部位，肛瘘术后一般不做缝合，创面大，容易感染，创面愈合缓慢，因此如何加快肛瘘术后创面修复就成为临床研究的热点[4-5]。中医外治是最古老的治法之一，尤其对肛肠疾病，中药制剂的外用能使药性直达病所，比内服更具有优势，故《医说源流》曰：“外科之证，最重外治”。肛门局部创面分泌物稠厚黄白等“湿”“热”的特点。除此之外，肛瘘术后，经脉受损，施术局部气血阻滞，与湿热相结，形成湿热蕴结，气滞血瘀的病理状态，采用清热利湿、活血化瘀、消肿止痛之中药，使湿热除，瘀血去，新血生，疮疡愈合。故如何运用清热利湿化瘀法于肛瘘术后关重要。

祖国医学认为通过中药外用，能够加速创面愈合，疗效明确。主要因为通过中药外用能促进组织周围的细胞释放相关生长因子，导致创面氧自由基的量和活性降低，进一步提高机体抗感染能力[6]。我院紫草油方以紫草为君，黄连为佐使。紫草味苦、甘，性寒。功效：活血、凉血、解毒透疹。《本草纲目》曰：“紫草，其功长于凉血活血，利大小肠。”紫草外用常调制成油膏，亦可以水浓煎用。治疗痈疽肿毒多用于溃后，或用于各种慢性溃疡，凡创面赤肿及渗出较多者用之可起清热消肿、减少渗出之功效，从而可生肌长肉，促进溃疡愈合。黄连味苦性寒，有清热、泻火解毒的功效。常用于湿热证等，又解毒疗疮．以治痈疽肿毒．口舌生疮等。二味共为君药共奏清热利湿、消肿止痛之功。

创面愈合就是一个复杂的修复过程，机体通过自身的再生能力，恢复创面表面的连续性和完整性。在这个复杂的生物学过程中，涉及多种组织和修复细胞、生长因子、细胞因子和胞外基质成分以及各种调控因素的共同参与。肉芽的主要成分是新生的毛细血管床和成纤维细胞[7]。创面愈合的主要修复细胞为成纤维细胞，直接影响胶原合成和分泌，而合成的胶原又是构成细胞外基质的主要部。研究也证实，TGF-β1/Smad信号通路的调控作用与创面愈合是密不可分的[8]。

TGF-β1是创面修复过程中重要的细胞因子，TGF-β/Smad信号通路重要的组成部分[9]。 TGF-β1作为TGF-β细胞因子家族的一员，与创伤愈合紧密联系[10-11]。TGF-β1不仅是成纤维细胞的强效趋化因子，也是一种抗炎细胞因子[12]。主要作用于炎症及修复细胞，可产生细胞的趋化性迁移、抗炎等生物学效应[13]。此外TGF-β是刺激创面肉芽组织形成最有效的细胞因子之一，而这一诱生过程是可逆的，可增加伤口组织抗张强度和促使血管新生，对表皮有明显促进愈合作用。相关研究[14]提示，TGF-β1/Smad信号通路对血管正常结构的维持有重要的作用。本实验研究中表明，三组药物干预均能上调TGF-β1mRNA及蛋白的表达，但术后第21天紫草油组中的TGF-β1mRNA及蛋白表达明显高于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05），提示紫草油能有效促进肛瘘术后创面的愈合，与紫草油外用作用于创面后上调TGF-β1mRNA有密切的关系。

Smad蛋白家族是细胞内重要的信号转导蛋白，直接参与 TGF-β 超家族成员 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形态发生蛋白（BMP）等多个成员的信号传导[15]。Smad2与Smad3属于共同介导性的Smad蛋白，是TGF-β1信号转导通路中特异的、起瓶颈作用的重要因子。然而真正反映TGF-β1/Smad3信号通路的激活水平与强度的是磷酸化Smad3表达水平[16-17]。因此相关研究表明提高磷酸化 Smad2、Smad3表达水平，可激活溃疡创面 TGF-β1/Smad3信号通路，加速伤口的修复[18]。相关研究表明敲除Smad3后，促使Smad3表达降低，创伤愈合明显加速[19]。本实验研究中表明，三组药物干预后Smad3表达逐渐下降。术后第21天紫草油组中的Smad3 mRNA及蛋白表达明显低于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05），提示紫草油能通过下调Smad3因子的表达，进而有效促进创面的愈合。

综上所述，TGF-β1/Smad3信号通路可多方面调节细胞增殖、分化及纤维化等过程[20]。本实验研究提示紫草油能促进肛瘘术后创面的愈合及缩短愈合时间，可能通过调节TGF-β1/Smad3信号转导通路中TGF-β1及Smad3因子表达水平。因此如何根据TGF-β1/Smad3通路的变化规律，有针对性地进行科学地调控，也是我们进一步研究的难点。

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