金果榄中古伦宾在家兔体内的药动学研究
曾浩涛
深圳市龙岗中心医院药剂科，广东深圳 518100
[摘要]目的 研究金果榄中古伦宾在家兔体内的药动学。方法 从金果榄的干燥块根中制备提取古伦宾，建立超高效液相色谱（UPLC）检测古伦宾方法。 色谱条件，色谱柱：Acquity UPLCRBEN C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.3%磷酸溶液-乙腈（65:35）；流速：1 ml/min；检测波长：225 nm；柱温：35℃。 考察该方法的专属性、线性、定量限、提取回收率、精密度和稳定性；测定不同浓度古伦宾对照品标准溶液的峰面积，制作古伦宾浓度标准曲线；对家兔进行古伦宾灌胃注药 （50 mg/kg）， 于给药后 0、15、30、60、120、180、240、360、480、1400 min 后进行耳缘静脉采血，测量古伦宾浓度，绘制血药浓度-时间曲线，运用WinNonlin 3.3软件计算相应古伦宾在家兔体内的药动学参数。结果 色谱图峰形显示，古伦宾保留时间在16 min，峰形正态分布，与其他峰分离良好，无内源性物质干扰。古伦宾浓度标准曲线方程为 Y＝502967X＋0.1501，相关系数 r＝0.995，线性范围为 0.00122 ～2.50000 nmol/L，最低定量限为1.22×10-3nmol/L。质量浓度为9.77、156.25、1250.00 nmol/L的古伦宾血浆溶液提取回收率均在80.0%以上，平均回收率为84.2%，相对标准偏差（RSD）=3.1%。156.25 nmol/L的古伦宾血浆溶液的日间RSD=3.5%。第1天日内RSD=1.7%，第2天日内RSD=4.6%。室温保存24 h，反复冻融3次，以及-20℃冷冻保存14 d时的回收率均为90.0% ～110.0%。 药动学参数：达峰时间（Tmax）=68.9 min、峰浓度（Cmax）=0.0671 nmol/L、末端消除半 衰 期（T1/2）=438.67 min、药时曲线下面积（AUC）=81.49、末端消除速率（Ke）=0.0017、清除率（CL）=20132.72、生物利用度（F）=14.08%。结论 UPLC法测定古伦宾浓度，其专属性、提取回收率、稳定性均符合要求，适用于对金果榄中古伦宾在家兔体内的药动学进行系统研究。
[关键词]古伦宾；金果榄；药动学研究；超高效液相色谱
[中图分类号]R977.9
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721（2018）9（b）-0013-05
[基金项目]广东省深圳市龙岗区科技发展资金医疗卫生项目（YLWS20150513163509153）
Pharmacokinetic study of columbin from Radix Tinosporae in rabbits in vivo
ZENG Hao-tao
Department of Pharmacy,Central Hospital of Longgang District in Shenzhen City,Guangdong Province,Shenzhen 518100,China
Department of Pharmacy,Central Hospital of Longgang District in Shenzhen City,Guangdong Province,Shenzhen 518100,China
[Abstract]Objective To study the pharmacokinetics of columbin from R adix Tinosporae in rabbits in vivo.Methods The columbin was extracted from the dried root of R adix Tinosporae,and the UPLC method for the determination of columbin was established.Chromatographic conditions,column:Acquity UPLCRBEN C18(2.1×100 mm,1.7 μm);mobile phase:0.3%phosphoric acid solution-acetonitrile(65:35);flow rate:1 ml/min;detection wavelength:225 nm;temperature:35°C.The specificity,linearity,quantitative limits,extraction recovery,precision and stability of the method were investigated.The peak area of the standard solution of different concentrations of culumbin was determined,and used to make the standard curve of the concentration of culumbin.The culumbin (50 mg/kg)was gavaged to rabbits,and limbic vein blood collection was conducted at 0,15,30,60,120,180,240,360,480 and 1400 min after administration.The blood concentration-time curve was drawn,and the corresponding pharmacokinetic parameters of culumbin in rabbits were calculated by using WinNonlin 3.3 software.Results Peak shape of the chromatogram showed that the retention time of culumbin was 16 min,with normal peak shape distribution.It was well separated from other peaks,and there was no endogenous material interference.The standard curve equation of culumbin concentration was Y=502967X+0.1501,the correlation coefficient r=0.995,the linear range was 0.00122-2.50000 nmol/L,and the minimum quantitative limit was 1.22×10-3nmol/L.The recovery rate of the plasma solution of culumbin at the mass concentration of 9.77,156.25 and 1250.00 nmol/L was over 80.0%,the average recovery rate was 84.2%,and the relative standard deviation (RSD)=3.1%.The RSD between two days of the 156.25 nmol/L culumbin plasma solution was 3.5%,the first day RSD was 1.7%,the second day RSD was 4.6%.Preserved 24 h at room temperature,repeated freezing,thawing 3 times,and-20℃cryopreservation 14 d average recovery was 90.0%-110.0%.Pharmacokinetic parameters:Tmax=68.9 min,peak concentration(Cmax)=0.0671 nmol/L,terminal elimination half-life(T1/2)=438.67 min,medication in the area under the curve(AUC)=81.49,end eliminate rate(Ke)=0.0017,clearance(CL)=20132.72,bioavailability(F)=14.08%.Conclusion The UPLC method was used to determine the concentration of columbin,and its specificity,extraction recovery and stability all meet the requirements,which is suitable for the systematic study of the pharmacokinetics of columbin in rabbits.
[Key words]Columbin;Radix Tinosporae;Pharmacokinetic study;Ultra high performance liquid chromatography
金果榄（Radix Tinosporae），别名青牛胆、山慈菇、地苦胆、金狮藤，是《中国药典》收录的草药，来源为防己科酸模属[1]。临床上具有清热解毒的功能，常用于治疗咽喉肿痛、痈疽疔毒、泄泻、痢疾以及脘腹疼痛等[2]。古籍《本草再新》认为金果榄：“滋阴降火，止渴生津”。《药性考》中提到：“解毒。咽喉痹急，口烂宜服。疽痈发背，蛇蝎虫伤，磨涂。治目痛，耳胀，热嗽，岚瘴，吐衄，一切外症”。金果榄与党参、丹参、当归和北沙参共同制成复方党参片，是活血化瘀、益气宁心的有效药物[3]。另外，金果榄在心肌缺血引起的心绞痛或胸闷等方面同样具有广泛的应用[4]。现代医学研究显示，古伦宾是金果榄中的有效成分之一[5]。对古伦宾的药动学进行研究，有助于从科学的角度全面的控制相关制剂的质量[6]，本研究利用UPLC检测方法对金果榄中古伦宾在家兔体内的药动学进行研究，现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Acquity UPLC超高效液相色谱仪（Waters，美国）；梅特勒XS105DU分析天平（梅特勒，瑞士）；DZKWS-4恒温水浴锅（北京市永光明医疗器械有限公司）。
1.2 药品与试剂
古伦宾由本课题组从金果榄的干燥块根中制备提取，结构示意图见图 1，结构式 C20H22O6，相对分子质量358.39。口服混悬剂购自Oral-plus（美国Paddock实验室）；古伦宾对照品（产品批号：111837-201703）购于中国食品药品检定研究院；甲醇（分析纯）、磷酸（分析纯）及乙腈（色谱纯）购于德国默克；超纯水为实验室自制。
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图1 古伦宾的结构示意图
1.3 实验动物
体质量2.5 ～3.2 kg的6只雄性家兔，均由学院实验动物中心提供，许可证号为GXXK（桂）2013-19。
2 研究方法
2.1 色谱条件
色谱柱：Acquity UPLCRBEN C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.3%磷酸溶液-乙腈（65:35）；流速：1 ml/min；检测波长：225 nm；柱温：35℃。
2.2 溶液配制
2.2.1 对照品溶液的配制 ①2 mmol/L古伦宾对照品储备液配制：分析天平准确称取古伦宾对照品0.0358 g溶解于少量空白血浆中，摇匀，利用空白血浆定容至5 ml，保存于-20℃冰箱中。②将储备液稀释制备系列标准溶液：将古伦宾对照品储备液用空白血浆稀释成2.50000、1.25000、0.62500、0.31250、0.15625、0.07813、0.03906、0.01953、0.00977、0.00488、0.00244、0.00122 nmol/L 系列的标准溶液。③质量控制溶液配制：将古伦宾对照品储备液用空白血浆稀释成浓度为 9.77、156.25、1250 nmol/L的溶液，每种溶液平行配制3份，保存于-20℃冰箱中。
2.2.2 血浆预处理方法 专用负压玻璃管，标注采血时间及试验号。将血液样本以15 000 r/min离心15 min，将血清血浆分离。移取100 μl血浆至新的离心管中。加入高氯酸（4.0 μg/ml）100 μl沉淀血浆中蛋白质及大分子脂类，以 15 000 r/min离心 10 min，取上清液 10 μl进行测定。
2.3 给药方案与样品采集
以50 mg/kg的灌药剂量对健康家兔进行灌胃给药，给药后于0、15、30、60、120、180、240、360、480、1400 min后进行耳缘静脉采血取血。每次取血量约1 ml，进行预处理后，平行进行6次实验。
2.4 数据分析与处理
制作血药浓度标准曲线，计算血药浓度，获取浓度数据后运用WinNonlin 3.3软件计算相应古伦宾在家兔体内的药动学参数。
3 结果
3.1 方法专属性考察
实验前取家兔血浆少量，并按照步骤“2.2.2项”下方法，进行预处理后作为空白血浆，分别利用“2.1项”色谱条件对空白血浆、古伦宾标准品、空白血浆+古伦宾标准品及给药960 min后的血浆样品（含古伦宾）进行定性分析。色谱图峰形显示，古伦宾保留时间在16 min，峰形正态分布，与其他峰分离良好，无内源性物质干扰，提示该方法专属性良好（图2）。
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图2 方法专属性考察结果
A：空白血浆；B：古伦宾标准品；C：空白血浆+古伦宾对照品；D：给药960 min后的血浆样品
3.2 线性和定量限考察
测定不同浓度古伦宾对照品标准溶液的峰面积平行3次试验（表1），以峰面积（Y）作为纵坐标，以浓度（X）作为横坐标，进行线性回归运算得标准曲线方程。软件处理得线性回归方程为Y＝502967X＋0.1501，相关系数r＝0.995。以信噪比（S/N）≥10计算定量限，最低定量限为1.22×10-3nmol/L。
表1 不同浓度古伦宾对照品标准溶液与峰面积的关系（n=3）
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3.3 提取回收率考察
取古伦宾对照品储备液适量，用空白血浆稀释制成质量浓度为9.77、156.25、1250.00 nmol/L的古伦宾血浆溶液，按照步骤“2.2.2项”下方法进行预处理并进行测定，利用线性回归方程计算检测古伦宾浓度，回收率（%）=检测浓度/理论浓度×100%，结果提示，质量浓度为9.77、156.25、1250.00 nmol/L的古伦宾血浆溶液提取回收率均在80.0%以上，RSD<10%，提示该方法准确度符合要求（表2）。
表2 提取回收率考察（n=3）
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3.4 精密度考察
取古伦宾对照品储备液适量，用空白血浆稀释制成浓度为156.25 nmol/L的溶液，平行配制6份样品进行分析，计算日内、日间精密度，RSD值在 10%以下，提示精密度良好，符合检测要求（表3）。
表3 精密度数据表（n=6）
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3.5 稳定性考察
取质量浓度为 9.77、156.25、1250 nmol/L的古伦宾血浆溶液，分别考察样本在处理后室温保存24 h，反复冻融3次，以及-20℃冷冻保存14 d的稳定性，结果提示，古伦宾在上述条件下回收率均为90.0% ～110.0%，基本稳定，该方法符合目前生物样品分析方法有关要求，可用于药动学研究（表4）。
表4 溶液稳定性考察
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3.6 药动学研究
按“2.3项”下血液样品采集方法，测定给药后不同时间的血药浓度（表 5），采用 WinNonlin 3.3软件计算和处理药动学参数，绘制血药浓度-时间曲线，主要药动学参数包括：达峰时间（Tmax）=68.9 min、峰浓度（Cmax）=0.0671 nmol/L、 末端消除半衰期 （T1/2）=438.67 min、药时曲线下面积（AUC）=81.49、末端消除速率（Ke）=0.0017、清除率（CL）=20132.72、生物利用度（F）=14.08%（图 3）。
表5 给药后不同时间点的古伦宾血药浓度（n=6）
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4 讨论
研究表明，金果榄中主要活性成分为古伦宾[7]。2010年版《中国药典》中，古伦宾已取代原来的盐酸巴马汀作为含量测定指标成分，用于评价金果榄药材质量[8]。有研究测定了不同产地金果榄药材中古伦宾的不同含量，借以确定判断金果榄质量优劣的新标准，高效液相色谱（HPLC）检验结果显示，重庆、广西崇左、陕西汉中和四川万源等地所产者含量相对较高，这些产地所产金果榄质量更优[9-10]。分析发现，对金果榄中古伦宾的含量测定方法的开发，是研究热点之一[11]。例如，崔小敏等[12]研究发现胶束电动毛细管色谱法可以准确测定金果榄中古伦宾的含量，采用未涂层熔融石英毛细管柱方法准确、可靠、环保，适用于金果榄中古伦宾和蝙蝠葛任碱含量的同时测定。张进芳等[13]采用HPLC测定复方党参片中古伦宾的含量，同样取得良好效果。
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图3 古伦宾灌胃给药方式后血药浓度-时间曲线
药动学研究的意义在于定量研究药物在机体内吸收、分布、排泄和代谢规律，为临床药物的用量用法进行指导[14-15]。家兔是进行药动学研究时较为常见的一种试验动物，包括氨茶碱[16]、布渣叶总黄酮[17]、金银花超微饮片[18]以及克癌素结肠包衣滴丸[19]等。古伦宾经口服给药后其药-时曲线如图3所示。采用非房室模型方法估算，经WinNonlin 3.3软件拟合数据后可获得古伦宾的药代动力学参数，古伦宾通过口服的吸收是很快速的。本研究结果提示，古伦宾通过口服可以到达快速吸收的效果。但口服古伦宾生物利用度仅为14.08%，利用度较低，可能是肝脏首过效应导致古伦宾较低的生物利用度[20]。
本研究建立了一种快速、灵敏和专属性强的UPLC法测定家兔中的古伦宾浓度及其吸收药代动力学特性。其专属性强、灵敏度高、准确可靠，血液中的最低定量限为1.22×10-3nmol/L。该方法精密度、提取回收率、稳定性均符合方法学考察要求。
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（收稿日期：2018-06-13 本文编辑：孟庆卿）