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过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）为常见病、多发病，分为季节性及常年性发作两种类型，随着社会环境条件的恶化，该病的发生率呈逐年上升的趋势。祖国传统医学认为过敏性鼻炎属“鼻鼽”的范畴，应用“辨证施治”及“治未病”等理论，中医药或少数民族医药治疗AR具有疗效确切、复发率低、毒副作用小等优势，研发治疗AR的中药或民族药产品有很好的市场前景[1-9]。十味鹅黄颗粒为广西中医药大学制药厂拟开发的治疗过敏性鼻炎的复方壮药制剂，产品在民间治疗过敏性鼻炎验方的基础上，按中医药君臣佐使理论组方。方中，鹅不食草、黄芪、白术益气固表、通鼻止喘为君药；防风、柴胡、白芷、辛夷祛风散寒、宣通鼻窍为臣药；广藿香、丹皮、乌梅活血祛瘀、凉血止痒、收敛止涕为佐药。诸药合用，共奏益气疏风、利窍通鼻之功效，用于脾肺气不足，外感风寒之鼻鼽病。

现代研究表明，十味鹅黄颗粒方中的君药黄芪对机体免疫系统、心脑血管系统具有明显的疗效，黄芪甲苷为黄芪的主要有效成分[10-13]；臣药辛夷临床中普遍用于治疗各种鼻炎，柴胡具有抗内毒素作用、免疫调节功能、抗过敏、抗细胞黏附等药理作用。辛夷和柴胡的主要指标成分分别为木兰脂素、柴胡皂苷A[14-20]。本研究综合考虑中药多指标、多成分、多靶点发挥作用的特点，以十味鹅黄颗粒水提液中黄芪甲苷、木兰脂素、柴胡皂苷A、总浸出物含量为代表性指标并进行多指标综合评分，应用正交试验，对十味鹅黄颗粒水提取工艺进行优化，为产品的注册申报及规模化生产提供依据，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（Agilent公司）；3300-ELSD型蒸发光散色检测器（Alltech公司）；SQP型十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KQ5200型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；L600型和TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究所，110781-200613）；木兰脂素对照品（上海源叶生物公司，R02J7F15582）；柴胡皂苷A（上海安谱实验科技股份有限公司，E3170010）。鹅不食草为菊科植物鹅不食草 Centipeda minima （L.） A.Br.et Aschers.的干燥全草；白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica （Fisch.Ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.的干燥根；防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根；广藿香为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin （Blanco）Benth.的干燥地上部分；丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮；乌梅为蔷薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.Et Zucc.的干燥近成熟果实。各药材均购自南宁市友和古城大药房，经广西中医药大学制药厂质量保证部检验合格。乙腈（色谱纯，Fisher公司）；超纯水由密思博超纯水机制备；氨水、正丁醇、甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 L9（34）正交试验因素水平的确定

十味鹅黄颗粒临床研究以水为提取溶剂，采用传统“汤剂”的形式，临床药效肯定，而且用水提取成本低廉，故产品提取工艺尊重临床疗效，采用水提的方式。影响水提取效果的主要因素为：①煎煮次数A；②煎煮时间B；③加水量C；④破碎度D。以上因素在三个水平上，进行正交试验优化，经水提预试后，采用L9（34）正交表进行正交试验（表1）。

表1 十味鹅黄颗粒水煎煮工艺条件L9（34）正交试验因素水平表

煎煮时间：每次煎煮药材的时间；加水量：每次所需处方药材总重量（g）溶剂的倍数

2.2 考察指标的确定及评价方法

2.2.1 水提工艺正交试验的评价本品方中君药黄芪中黄芪甲苷、臣药辛夷中木兰脂素、柴胡中柴胡皂苷A的含量高低，与本品的有效性密切相关，另外，总浸出物可以综合衡量处方中其他药材成分的含量。因此，确定用十味鹅黄颗粒水提液中黄芪甲苷、木兰脂素、柴胡皂苷A、总浸出物含量作为代表性指标，评价水提工艺的优劣。

2.2.2 考查方法以产品水提液中黄芪甲苷最高含量为40分，计算每个样品的相对得分；水提液中木兰脂素、柴胡皂苷A、总浸出物的最高得量均为20分，计算每个样品的相对得分；以上四项得分相加，即为每个样品的综合评分。

2.3 水提取液样品的制备

依据处方药材量，按正交设计试验表安排试验，合并煎液，混匀，滤过，滤液浓缩后定容至1000 ml，作为供试液。

2.4 总浸出物的测定

精密量取供试液100 ml，置于已经105℃干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，80℃减压干燥至恒重，称定重量，计算干膏量。

2.5 水提液中黄芪甲苷、木兰脂素、柴胡皂苷A含量的测定

根据课题组前期采用HPLC-ELSD法，同时测定十味鹅黄颗粒中黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素的含量。

2.5.1 色谱条件依据2015年版《中国药典》高效液相色谱法，色谱柱：美国安捷伦公司ZORBAXEclipseXDBC18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱（表2）；流速：1 ml/min；柱温：30℃；进样量：10 μl；Alltech3300-ELSD型蒸发光散射检测器参数（漂移管温度：80℃，气体流量：2.5 L/min，增益值：4.0）。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.5.2 对照品溶液的制备分别取黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素适量，精密称定，用甲醇溶解配制成质量浓度分别2.20、2.12、3.24 mg/ml的对照品溶液。分别吸取上述溶液适量定容至同一容量瓶中，加甲醇稀释制备成含黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素浓度分别为0.816、0.191、0.518 mg/ml的混合对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液的制备及测定称取“2.4方法”制备的十味鹅黄颗粒水提液干浸膏2 g，精密称定，精密加入25 ml 10%氨水，回流 30 min，以 6000 r/min离心10 min，取上清液；回流提取2次。残渣加入5 ml 10%氨水洗涤2次，离心。合并上清液，用水饱和正丁醇萃取2次，第1次加100 ml，第 2次加50 ml，合并正丁醇液，于水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解，移至5 ml容量瓶，定容，摇匀，以13 000 r/min离心10 min，上清液即为供试品溶液。供试品溶液按“2.5.1方法”测定各有效成分的含量。

2.6 试验结果

分析正交试验结果表明，各因素对提取效率的影响依次为：煎煮次数>加水量>破碎度>煎煮时间，提取工艺的最佳水平组合为A3B1C3D2（表3）。方差分析结果可知，煎煮次数与加水量对提取总体有显著性影响，而煎煮时间与破碎度对提取影响无差异性（表4）。因此，从提高工效考虑，确定水提工艺为药材加水14倍，煎煮3次，每次1 h。

表3 十味鹅黄颗粒水煎煮工艺条件正交试验L9（34）及其优化结果表

表4 十味鹅黄颗粒水煎煮工艺条件正交试验方差分析表

F0.01（2，2）=99.0，F0.05（2，2）=19.0

表5 水提优化工艺验证结果表（n=3）

2.7 正交优化结果验证实验

为验证正交优化工艺的可行性及稳定性，按上述水提优化工艺重复3次，所得清膏干燥后测定黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素含量，计算干膏得率。结果表明，优化的水提工艺可将药材的有效成分基本提取完全，且重复性好，具有可操作性（表5）。

3 讨论

本研究前期建立了采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法同时测定十味鹅黄颗粒中黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素含量的方法，并进行了方法学考察。结果提示，黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素分别在0.0816～0.816、0.0191～0.191、0.0518～0.5184 mg/ml范围内，其峰面积的自然对数与进样量的自然对数成良好的线性关系（r=0.995、0.9935、0.9942），平均加样回收率分别为101.5%，100.9%和101.5%，RSD 为 0.51%、0.56%、0.34%（n=6）。色谱条件选择时，分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液流动相，以及对柱温、蒸发光检测器参数（温度、气体流量、增益值）等色谱条件进行考察，结果提示，采用乙腈-水为流动相，柱温30℃，蒸发光参数为温度80℃，气体流量为2.5 L/min，增益值4.0，得到的色谱图较好。实验结果提示，本法简便快速、重复性好，结果准确，可作为十味鹅黄颗粒产品及生产过程中的质量控制方法，从而达到较好地控制产品质量的目的。

本研究制剂处方中，黄芪为君药，辛夷和柴胡为臣药，黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素分别为黄芪、柴胡和辛夷的主要有效成分。本研究依据处方“君臣佐使”的配伍原则，兼顾中药多成份、多靶点作用的特点，采用正交设计结合多指标综合评分法，以制剂水提液中黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素的含量及总浸出物为考察指标，优选产品的水提工艺，并经工艺验证实验提示，药材加14倍量水，煎煮3次，每次1 h为最佳水提工艺，按此工艺提取生产的产品，干膏中黄芪甲苷、柴胡皂苷A及木兰脂素平均含量分别为 5.78、1.78、3.30 mg/g，RSD 为 1.56%、2.77%、0.61%（n=3）；该水提工艺重现性好，质量稳定、可控，适合大生产使用；本工艺的优选试验，为产品后续的中试研究、稳定性试验及药理药效学研究提供了理论基础。另外，本试验结果提示，产品按水提工艺处理后，干膏得率约22%，使得单剂药量偏大，患者服用不方便，并可能导致成品颗粒吸湿性大，影响产品稳定性。为减少单剂服用药量，下一步研究将采用水煎煮得到的清膏经乙醇沉淀除去杂质的方法，降低干膏得率，并考察醇沉工艺对产品中有效成分含量的影响，以便筛选适合大生产的醇沉工艺参数。

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