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[Abstract]Objective To study the effect of radiofrequency energy on the cell activity of articular cartilage,so as to verify the clinical feasibility of this technique.Methods A total of 10 pairs of bovine articular cartilage were selected,of which five pairs were used as radiofrequency energy subjects.The sides of each pair were divided into four table cells,of which three ones were for research,respectively corresponding to SCULPTOR monopolar radiofrequency head,SAPHYRE bipolar radiofrequency head,and TAC-CⅡcartilage temperature-controlled head for 1 min.The remaining one was as a control without radiofrequency.The rest five pairs were selected as experimental subjects in different processing time(5,10,20,and 30 second),of which four pairs disposed with SAPHYRE bipolar radiofrequency head were selected as the research group and the last one without disposal was selected as the control group.The above-mentioned research groups and control groups were compared in order to observe the differences of hematoxylineosin staining(HE staining),fluorescence staining,and GAG release rate,and the differences of cell activity and tissue damage were analyzed.Results The vacuolization rate and mortality rate of the HE staining and fluorescence staining in the SCULPTOR monopolar radiofrequency head group,the SAPHYRE bipolar radiofrequency head group,and the TAC-CⅡcartilage temperature-controlled head group were significantly higher than those of the control group,and the differences were statistically significant(P<0.05).On the first day,the soft tissue GAG release rate in the SCULPTOR monopolar radiofrequency head group,the SAPHYRE bipolar radiofrequency head group,and the TAC-CⅡcartilage temperature-controlled head group was significantly lower than that in the control group;on the second and third days,the GAG release rate of soft tissue of the SAPHYRE bipolar radiofrequency head group and the TAC-CⅡcartilage temperature-controlled head group was significantly lower than that of the control group,and the differences were statistically significant(P<0.05).The vacuolization rate and the mortality rate of the HE staining and fluorescence staining in the 5,10,20,and 30 s treatment groups were significantly higher than those in the control group,and the differences were statistically significant(P<0.05).On the first,second,and third days,the GAG release rate of soft tissue in the 5,10,20,and 30 s treatment groups were significantly lower than that in the control group,and the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion The increase of radiofrequency energy and processing time both will lead to the damage of the joint soft tissue in a positive correlation.Therefore,it is necessary to appropriately reduce the radiofrequency energy and processing time in order to avoid tissue damage in patients during treatment.

骨性关节炎是一种慢性关节疾病，主要是造成关节处的组织病变，导致患者活动能力受限，还会伴随着疼痛等不良症状，对中老年人的生活质量影响较大。＞60岁人群里，约70%具有骨性关节炎的症状[1]，且居民生活水平的提升提高了现代居民的寿命，骨性关节炎的发病率也呈现升高的态势，目前已成为关节外科学较为关注的重点。随着关节镜手术的普及，作为其技术组成的重要部分——射频技术也得到发展，且已被临床广泛用于骨性关节炎、软骨损伤、滑膜清理等手术。但仍有很多专家学者对射频技术持有怀疑态度，射频汽化在治疗软骨损伤时，对残余软骨的活性影响仍然是争论的焦点。因此，本研究拟通过牛膝关节实验，科学验证射频对软骨活性的影响，旨在对今后临床应用射频产生指导性意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取10对屠宰场得到的新鲜完整牛膝关节，无菌条件下暴露股骨髁部关节软骨面，刀片轻轻刮除表面软骨膜，骨锉锉毛关节软骨表面，制作Ⅱ级软骨退变模型。主要试剂包括5 mg/L浓度的碘化丙啶（PI）溶液、3 mg/L的二乙酸荧光素（FDA）溶液、1.4 mg/ml的阿尔新蓝（AB）溶液以及不同浓度的硫酸软骨素（CS）溶液。

1.2 方法

1.2.1 射频操作仪器设备采用美国施乐辉公司生产的射频汽化等离子系统（Smith&Nephew，Endoscopy，Andover，MA)，主机型号为：Vulcan EAS，射频头包括：SCULPTOR单极射频头、SAPHYRE双极射频头、TAC-CⅡ软骨温控头。模拟关节镜手术环境，无菌条件下将标本浸泡于室温生理盐水中，以轻接触模式使用射频治疗软骨损伤区域。取5对牛膝关节作为射频能量实验对象，在无菌条件下每副牛膝关节在股骨内侧髁和外侧髁分别建立4个1.5 cm2×1.0 cm2实验区，共得到40个实验区。每个试验区用刀片分为4个单元格，其中3个是研究组，分别对应SCULPTOR单极射频头、SAPHYRE双极射频头、TAC-CⅡ软骨温控头处理（即SCULPTOR单极射频头组、SAPHYRE双极射频头组、TAC-CⅡ软骨温控头组），处理的时间设定为1 min，剩余1个为对照组，不做射频处理。

取剩下的5对牛膝关节作为射频能量实验对象，在无菌条件下每副牛膝关节在股骨内侧髁和外侧髁分别建立5个1.5 cm2×1 cm2的实验区，共得到50个实验区。每个试验区用刀片分为5个单元格，其中4个单元格是研究组，处理时间分别对应为5、10、20、30 s（即5 s时间处理组、10 s时间处理组、20 s时间处理组、30 s时间处理组），均使用SAPHYRE双极射频头进行射频处理，剩余1个作为对照组，不做射频处理，共获取50份标本。

1.2.2 组织学评估选取每个研究组中的10份标本以及对照组中的10份标本，依照网格线全层取下关节软骨，直接放入24孔培养板培养（DMEM培养基，100 ml/L FBS，37℃ 50 ml/L CO2），日期记录为第1天，用于软骨细胞组织学检测。培养到第3天，沿组织块中央切开，分为A、B两部分。A部分用于活性检测，均分为A1和A2两部分，B部分用于GAG释出率测定。

1.2.3 活性检测使用HE染色对A1部分组织蜡块染色后，在高倍显微镜下观察10个视野，记录细胞空泡的个数，空泡率=空泡个数/细胞总数×100%。使用荧光染色对A2进行染色，在高倍镜、蓝色光照射下观察细胞的颜色，死细胞呈现鲜红色，活细胞为绿色，记录其死亡率，死亡率=死亡细胞个数/（死亡细胞+活细胞）个数×100%。

1.2.4 软骨组织GAG释出率测定葡糖胺聚糖是软骨细胞外间隙的主要成分，是由软骨细胞合成并分泌于胞外的糖类[2]，因此，在体外试验中，其可作为早期判断软骨细胞活性的一种指标。选取每个研究组中的10份标本以及对照组中的10份标本，依照网格线全层取下关节软骨，组织块用电子天平称质量并记录，无菌下切成1 mm的3个小块。GAG相对释出量=GAG含量/组织块质量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同射频能量组活性检测结果的比较

SCULPTOR单极射频头组、SAPHYRE双极射频头组、TAC-CⅡ软骨温控头组的细胞HE染色、荧光染色的空泡率和死亡率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 不同射频能量组活性检测结果的比较（%，

±s）

2.2 不同射频能量组软骨组织GAG释出率的比较

第1天，SCULPTOR单极射频头组、SAPHYRE双极射频头组、TAC-CⅡ软骨温控头组的软组织GAG释出率显著低于对照组，第2、3天，SAPHYRE双极射频头组、TAC-CⅡ软骨温控头组的软组织GAG释出率显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 不同射频能量组软骨组织GAG释出率的比较（mg/g，

±s）

与对照组同期比较，*P<0.05

2.3 不同处理时间组活性检测结果的比较

采用5、10、20、30 s时间处理组的细胞HE染色、荧光染色的空泡率和死亡率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

表3 不同处理时间组活性检测结果的比较（%，

±s）

2.4 不同处理时间组软骨组织GAG释出率的比较

第 1、2、3 天，采用 5、10、20、30 s时间处理组的软组织GAG释出率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。

表4 不同处理时间组软骨组织GAG释出率的比较（mg/g，

±s）

与对照组同期比较，*P<0.05

3 讨论

关节镜手术在治疗软骨损伤上表现出了较好的临床效果，尤其在关节炎的治疗上已经取得了一些研究成果，微创手术方式在治疗骨性关节炎的发展趋势也较好，其能够减少患者病痛，也降低了更换人工关节的概率，不仅提升了患者的生活质量，还降低了治疗花费，具有较高的实际意义。但是该方法可能会对患者的组织造成损伤，或影响细胞的活性，存在较高的风险。本研究从实验角度验证射频对关节软骨的危害程度，期望能够在射频头、能量设定、治疗时间与关节软骨维持活性之间找到平衡点，既达到治疗目的，又避免造成更多软骨细胞的坏死[3-4]。

本研究结果提示，射频能量、持续时间对效果的影响有一定的规律。SCULPTOR单极射频头组、SAPHYRE双极射频头组、TAC-CⅡ软骨温控头组的细胞HE染色、荧光染色的空泡率和死亡率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且随着能量增加，数值升高，死亡率也随着射频能量的升高而升高，并在使用SAPHYRE双极射频头、TAC-CⅡ软骨温控头处理时达到了100%。由此可初步得出，射频能量越高，越容易对组织细胞活性造成影响，其对组织的损伤是永久性的。这与姚筱等[5-8]的研究结果基本相似，当能量达到40 W以上时，细胞活性下降十分明显，空泡率、死亡率与正常比较，差异有统计学意义（P<0.05）。本研究结果提示，第1天，SCULPTOR单极射频头组、SAPHYRE双极射频头组、TAC-CⅡ软骨温控头组的软组织GAG释出率显著低于对照组，第2、3天，SAPHYRE双极射频头组、TAC-CⅡ软骨温控头组的软组织GAG释出率显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示随着射频能量的增加，组织GAG的释出率也降低，这是因为细胞活性降低，其合成减弱，而分解增强，导致软骨基质受损较为严重。本研究结果还提示随着处理时间的增加，细胞的空泡率、死亡率也明显升高，采用5 s时间处理时，其第1天和第2天的空泡率和死亡率分别为（29.58±4.77）%、（55.48±4.11）%，高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；采用30 s时间处理，其第1天和第2天的空泡率和死亡率则达到了（55.24±4.15）%、（100.00±0.00）%，显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），使用SAPHYRE双极射频头（40W）时，处理时间超过30 s，就会造成组织细胞的全部死亡。另外本研究结果还提示，第 1、2、3 天，采用 5、10、20、30 s时间处理组的软组织GAG释出率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），随着处理时间的增加，GAG释出率也明显降低，第1天就达到峰值，之后每一天都处于下降的态势，且处理时间越长，数值越低，到第3天，20 s组和30 s组的GAG释出率接近0。这与宋长志等[9]的研究结果相近，GAG释出率的降低一方面受细胞活性的影响，导致GAG合成减少，另一方面可能是因为射频照射导致组织结构变得致密，GAG释出困难。初步预测，使用SCULPTOR单极射频头，照射时间为10 s能够取得一定效果[10-18]，且对软组织细胞的损伤较低，可以作为预选方案。但由于本研究使用的牛膝关节较薄，且需要制作为标本，形成了机械损伤，可能导致实验结果出现偏差，需要进一步验证射频的能量设定和处理时间选择。

综上所述，射频能量和处理时间的增加都会导致关节软组织受损，且与增加数值成正相关，因此需要适当降低射频能量和处理时间，避免治疗时对患者形成组织损伤。具体的治疗方案和治疗条件需要学者们进一步精确验证，随着医学及相关科学技术的发展，该种治疗方式的可行性和治疗效果会越来越好。

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