Article Info

如何寻找确实而可靠的方法替代动物实验，在许多研究领域已显得日益重要，特别是在皮肤研究方面，动物实验替代方法的开发对于更好地认识皮肤生理，评价各种化妆品安全性、有效性等具有非常重要的意义。组织工程皮肤的问世，使有关动物的皮肤替代实验成为可能。组织工程皮肤的基本原理是，通过获得自体或异体的极少量组织，在实验室中经过灭菌、消化、分离、培养，在获得足够的细胞数量时，将其重组成具有一定形态和功能的组织器官。随着细胞培养技术和组织构建技术的提高，可以根据不同的需要，构建单纯的表皮、真皮，或同时含有表皮和真皮的全层皮肤。近年来，组织工程皮肤研究取得了可喜的成果，相继有产品上市，这使得组织工程皮肤的应用不仅仅局限于治疗，而开始应用于其他领域，如化妆品安全性检测等，为皮肤检测模型代替动物进行皮肤试验奠定了基础。种子细胞是组织工程皮肤的重要部分，现就其相关研究进行综述。

1 表皮细胞

1.1 表皮细胞来源

表皮细胞来源于胚胎外胚层。角质形成细胞（keratinocytes）是表皮的主要组成细胞，属于终末分化细胞，随着传代次数的增加，其会出现老化，增殖能力也会逐渐下降。上皮角质形成细胞的来源多数取新生儿包皮组织体外获取，组织供应无法保持稳定导致皮肤模型无法批量生产[1]。由于异体细胞可引起机体的排斥反应，因此如何短时间内获取大量的自体表皮细胞，对于急需覆盖创面的大面积烧、创伤患者是丞待解决的问题之一。

1.2 永生化的上皮角质形成细胞HaCaT[人用生化表皮细胞（immortalized human epidermal cells）]

HaCaT不具有致瘤性并且保留了角质形成细胞的分化特性，其增殖能力强，培养简单，并且容易大规模培养[2-3]。目前对HaCaT细胞的研究越来越多，例如其分化的机制[4]。研究认为HaCaT细胞是经人乳头瘤病毒转染诱导形成的细胞系，其可以增殖和分化成12～15个细胞层次的表皮结构，非常接近正常皮肤的表皮，因此具有和与正常角质形成细胞相似的生物学特性，并且其不具有致瘤性，也无侵袭性[5]，可以作为体外构建组织工程皮肤的种子细胞[6]。目前已经有学者利用HaCaT细胞构建出组织工程皮肤[7-8]，研究其是否可以应用于创面修复[9]。

2 成纤维细胞

成纤维细胞是皮肤真皮层中主要细胞，特别是胚胎成纤维细胞的培养，其比普通成纤维细胞增殖能力更强，免疫原性更低，有研究其具有无限增殖能力接近细胞系的性能[10]。上皮角质形成细胞加入成纤维细胞构建皮肤模型时，细胞生长因子（bFGF）分泌增加，促进创面恢复的能力更强，目前成纤维细胞的应用非常广泛。组织工程皮肤的构建加入成纤维细胞更加接近正常的皮肤结构。

3 干细胞

干细胞是一类多潜能细胞，具有自我更新的特性和无限增殖能力，经诱导后可以定向分化。干细胞来源表皮干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞等均可作为构建皮肤组织工程皮肤的种子细胞。

3.1 表皮干细胞

表皮干细胞具有无限更新能力，并且经诱导后可以分化形成表皮细胞。表皮干细胞位于表皮的基底层。表皮不断的自我更新主要就是依赖于皮肤基底细胞层中的干细胞，但是基底层的细胞只有少量是干细胞[11]，其在基底层的位置也是不断变化的[12]。P63、CD29双标记法经常被作为鉴定表皮干细胞的便捷的方法，其敏感性较低，但是特异性较高。表皮干细胞在维持皮肤新陈代谢中起重要作用。有学者研究认为表皮干细胞有分化为汗腺和毛囊等结构的潜能[13]，而在上皮组织的修复过程中缺少表皮干细胞其修复程度将受到明显的影响[14]。表皮干细胞实现皮肤自我更新主要通过产生出大量的扩增细胞[15]，表皮干细胞分化阶段不同，其标志物也在不断变化,表达 α2β1，α3β1等整合素，黏附邻近细胞。Sun等[16]利用毛乳头细胞诱导毛囊隆突部培养的干细胞再生毛囊结构为组织工程皮肤毛囊化更进一步提供理论研究。随着各种研究的不断深入，表皮干细胞可分化为毛囊、皮脂腺、汗腺等。作为组织工程皮肤的种子细胞之一的表皮干细胞，将来有可能解解决组织工程皮肤缺乏皮肤附属器的难题，使组织工程皮肤能真正大量应用于临床[17]。

3.2 间充质干细胞（MSCs）

MSCs来源于中胚层和外胚层，是免疫原性低的成体干细胞，也是干细胞家族的重要成员之一，是构成骨髓微环境的主要细胞成分之一，其对各类免疫细胞均具有免疫调节作用。研究发现MSCs可通过调节T细胞的活化和增殖来抑制免疫反应[18-19]，其可通过细胞间直接接触[20-21]对T细胞进行调节，也可通过分泌可溶性因子来调节T细胞。由于其具有取材方便、培养容易、增殖力强、低免疫原性、表达稳定的特点，因此MSCs在特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞。MSCs主要包括骨髓MSCs、人脐带MSCs、脂肪MSCs、毛囊干细胞等。

3.2.1 骨髓MSCs在骨髓组织中含量最为丰富，来源于中胚层和外胚层。其为自体干细胞，取材方便，培养容易，增殖能力强，并且无排斥反应，外源基因转染表达稳定。其在适宜的微环境下可分化多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、神经星型胶质细胞等[22-23]。在皮肤出现大面积严重损伤的修复过程中，在创伤较大创面难愈合的创面加入骨髓MSCs，可加速创面的愈合[24]。近年来研究发现自体骨髓MSCs在一定条件下可转变为表皮细胞及皮肤附属器细胞[25]，还能促进新生血管形成，加速创面愈合。

3.2.2 脐带MSCs起源于中胚层，其产生的微环境对造血干细胞的归巢及增殖分化意义重大。其主要存在于脐带沃顿胶和血管周围组织中[26]。人脐带MSCs能够向心肌和骨骼肌方向分化，还可以向成骨细胞和软骨细胞等方向分化，还具有支持造血干细胞的扩增。有研究表面组织来源不同的脐带血MSCs的免疫表型特征却非常相似[27]。由于人脐带血MSCs不受伦理和道德约束，排斥反应小，由于脐带胎盘的保护感染细菌和病毒风险很低，并且没有形成畸胎瘤的风险。因此，人脐带MSCs在血液病、老年痴呆、帕金森等疾病治疗等方面提供新的治疗方案。

3.2.3 脂肪MSCs在2001年由Eppley[28]离体培养得到，证实具有干细胞的功能，可以取材于不同部位的脂肪组织。其具有来源充足、易于在体外培养扩增、干细胞含量丰富、无致瘤性等优点。脂肪MSCs在一定的诱导条件下可以向成骨细胞[29]、干细胞[30-32]、神经细胞[33]、肌肉细胞[34]等定向分化。可表达 CD11a、CD13、CD14、CD29[35-37]，不表达 CD40、CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ等生物学特性。因此，今后在自体脂肪移植及组织工程皮肤构建等方面有很大的研究及应用价值。

4 其他细胞

其中包括内皮细胞、黑色素细胞等。Rehder等[38]在体外构建的组织工程表皮中加入黑色素细胞，结构所构建出的皮肤模型在形态学上与非常接近正常皮肤，为研究皮肤光老化进一步奠定基础。也有研究表明将汗腺干细胞移植到裸鼠背部全层皮肤缺损上，其创面血管化明显，加速创面修复能力[39]。

5 展望

构建组织工程皮肤的目的是使其在形态上和功能上非常接近正常皮肤，除了具有表皮和真皮结构还有皮肤附属器的结构，能快速血管化及神经重建。虽然已经有很多组织工程皮肤问世，但仅仅是表皮替代物或真皮替代物，缺乏皮肤附属器，不具有真正的皮肤功能。近些年来随着对干细胞的深入研究，合适的种子细胞是组织工程皮肤构建成功的关键，但是如何提高种子细胞的安全性、增殖分化能力及降低免疫特性及干细胞特异性标记等问题，需要进一步深入研究。以后将会有越来越多功能完善的组织工程皮肤研究成功，为广大创伤者带来希望。

[参考文献]

[1]Zhang ZG，Bothe I，Hirche F，et al.Interactions of primary fibroblasts and keratinocytes with extracellular matrix proteins：contribution of α2β1intergrin[J].J Cell Sci，2006，119（Pt9）：1886-1895.

[2]Cichowski A，Kawecki M，Glik J，et al.Literature review concerning cell and skin substitute cultures obtained by means of tissue engineering used in the treatment of burns[J].Pol Przegl Chir，2014，86（4）：202-210.

[3]Terada D，Yokoyama Y，Hattori S，et al．The outermost surface properties of silk fibroin films reflect ethanoltreatment conditions used in biomaterial preparation[J]．Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2016，58：119-126.

[4]Miles A，Berthet A，Hopf NB，et al．A new alternative method for testing skin irritation using a human skinmodel：a pilot study[J]．Toxicol In Vitro，2014，28（2）：240-247．

[5]Huang S，Xu Y，Wu C，et al．In vitro constitution and in vivo implantation ofengineered skin constructswith sweat glands[J]．Biomaterials，2010，31（21）：5520-5525．

[6]Wang X，You C，Hu X，et al.The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of fullthickness skin defects in rats[J].Acta Biomater，2013，9（8）：7822-7832．

[7]Shevchenko RV，James SL，James SE.A review of tissue engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction[J].J R Soc Interface，2010，7（43）：229-258.

[8]Han Y，Tao R，Han Y，et al.Microencapsulated VEGF gene-modified umbilical cord mesenchymal stromal cells promote the vascularization of tissue-engineered dermis：an experimental study[J].Cytotherapy，2014，16（2）：160-169.

[9]Groeber F，Holeiter M，Hampel M，et al.Skin tissue engineering-in vivo and in vitro applications[J].Clin Plast Surg，2012，39（1）：33-58.

[10]Nayak S，Dey S，Kundu SC.Skinequivalent tissue-engineered construct：co-cultured fibroblasts/keratinocytes on 3D matrices of sericin hope cocoons[J].PLoS One，2013，8（9）：e74779.

[11]Pfuhler S，Fautz R，Ouedraogo G，et al.The cosmetics europe strategy for animal-free genotoxicity testing：project status up-date[J].Toxicol In Vitro，2014，28（1）：18-23.

[12]Zhao Z，Zhang C，Fu X，et al.Differentiated epidermal cells regain the ability to regenerate a skin equivalent by increasing the level of β-catenin in the cells[J].Cells Tissues Organs，2012，196（4）：353-361.

[13]Li MH，Liu Y，Chen C，et al.Effect of combined use of autologous adipose-derived stem cells and sterile biological filmson chronic wound[J].Med J Chin PLA，2016，41（12）：1025-1030.

[14]Fuchs E.The impact of cell culture on stem cell research[J]Cell Stem Cell，2012，10（6）：640-641.

[15]赖麒，熊爱兵.表皮干细胞的生物学特性及应用[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（36）：6813-6816

[16]Sun H，Wang X，Hu X，et al.Promotion of angiogenes is by sustained release of rhGM-CSF from heparinized collagenchitosan scaffolds[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2015，100（3）：788-798.

[17]Sekiya S，Shimizu T，Okano T.Vascularization in 3D tissue using cell sheet technology[J].Regen Med，2013，8（3）：371-377.

[18]Auger FA，Lacroix D，Germain L.Skin substitutes and wound healing[J].Skin Pharmacol Physiol，2014，22（2）：94-102.

[19]Bartholomew A，Sturgeon C，Siatskas M，et al.Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo[J].Exp Hematol，2002，30（1）：42-48.

[20]Azzam OA，Bassiouny DA，Ei-Hawary MS，et al.Treatment of hypertrophic scars and keloids by fractional carbon diox-ide laser.a clinical，histological， and immunohistochemical study[J].Laser Med Sci，2016，31（1）：9-18.

[21]Varkey M，Ding J.Tredget in skin substitutespotential of tissue engineered skin for facilitating anti-fibrotic healing[J].J Funct Biomater，2015，6（3）：547-563.

[22]Nogueira M，Rodas C，Leite A，et al.Preparation and characterization of ethanol-treated silk fibroin dense membranes for biomaterials application using waste silk fibers as raw material[J].Bioresource technol，2010，101（21）：8446-8451．

[23]Yang W，Cui ZF.The development of tissue engineering skin[J].Scientia Sinica Vitae，2015，45（5）：460-470.

[24]李海红，付小兵，王君，等.间充质干细胞分化为表皮附属细胞的初步实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2006，20（6）：675-678.

[25]Ma ZF，Chai JK，Yang HM，et al.In vitro construction of tissue engineered skin for wound repair after escharectomy of third degree scald：an experimental study[J].Med J Chin PLA，2015，40（12）：972-975.

[26]Grauvogel J，Daemmrich TD，Ryschich E，et al．Chronic alcohol intake increases the severity of pancreatitis induced by acute alcohol administration，hyperlipidemia and pancreatic duct obstruction in rats[J].Pancreatology，2015，10（5）：603-612．

[27]Hackert T，Pfeil D，Hartwig W，et al.Platelet function in acute experimental pancreatitis induced by ischaemia－reperfusion[J].Br J Surg，2005，92（6）：724-728．

[28]Eppley BL.Expermental assessment of the revasecularization of acellular human dermis for soft－tissue augmentation[J].Plast Reconstr Surg，2001，107（3）：757-762.

[29]Gilhar A，Yaniv R，Assy B，et al.Fas pulls the trigger on psoriasis[J].Am J Pathol，2006，168（1）：170-175.

[30]Banjul-Feria Mendez M，Folgers AR，Cabrera S，et al.Matrix metallophones：evolution，generegulationandfunctionalanalysis in mouse models[J].Biochip Biophys Acta，2010，1803（6）：3-19．

[31]Van der Veen VC，Boekema BK，Ulrich MM，et al.New dermal substitutes[J].Wound Repair Regen，2011，19（Suppl1）：59-65．

[32]Ehrenreich M，Ruszczak Z.Update on tissue-engineered biological dressings[J].Tissue Eng，2006，12（9）：2407-2424.

[33]Supp DM，Supp AP，Bell SM，et al.Enhanced vascularzation of cultured skin substitutes genetically modified to overexpress vascular endothelial growth factor[J].J Invest Dermatol，2000，114（1）：5-13.

[34]Hohlfeld J，de Buys Roessing A，Hirt-Burri N，et al.Tissue engi neered fet al skin constructs for paediatric burns[J].Lancet，2005，366（9488）：840-842.

[35]Mvula B，Abrahamse H.Differentiation potential of adipose-derived stem cells when cocultured with smooth muscle cells，and the role of low-intensity laser irradiation[J].Photomed Laser Surg，2016，34（11）：509-515.

[36]Razavi S，Razavi MR，Ahmadi N，et al.Estrongen treatment enhances neurogenic differentitation of human adisope derived stem cells in vitro[J].Iran J Basic Med Sci，2015，18（8）：799-804.

[37]Nagata H，li M，Kohbayashi E，et al.Cardiac adipose-derived stem cells exhibit high differentiation potential to cardiovascular cells in C57 potential BL/6Mice[J].Stem Cells Transl Med，2016，5（2）：141-151.

[38]Rehder J，Souto LR，lssa CM，et a1．Model of human epidermisreconstructedinvitrowithkcratinocytesand melanocytes on dead de-epidermized human dermis[J].Sao Paulo Med J，2004，122（1）：22-25．

[39]Klar AS，Guven S，Biedermann T，et al.Tissue-engineered dermoepidermal skin grafts prevascularized with adiposederived cells[J].Biomaterials，2014，35（19）：5065-5078.