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气道重塑是呼吸系统慢性疾病如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘等长期反复发作出现的病理过程。长期反复的炎症刺激，会导致肺上皮细胞损伤，使其向间质细胞转化。研究显示，TGF-β被认为是促使肺上皮细胞间质化的关键因子[1-2]，而β-catenin是TGF-β1发挥作用的重要途径。在肾脏上皮细胞采用ICG001特异性地阻断β-catenin的转录活性，可以抑制TGF-β1诱导的间质转化[3]。目前，维生素 D（Vitamin D，VD）被认为可改善气道平滑肌增生、杯状细胞增生、上皮下纤维化等气道结构功能的作用，从而改善呼吸系统慢性疾病的气道重塑[4]。气道上皮细胞高表达1α-羟化酶和VD受体，可将无活性的VD转化为有生理活性的VD[5-6]。Hlaing等[7]的研究显示，在心肌细胞中VD可以负向调控Wnt/β-catenin信号通路，抑制心肌细胞增殖，促进心肌细胞分化，但VD是否通过βcatenin信号通路来调控大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化尚未见报道。本研究通过VD或（及）ICG001预处理RLE-6TN细胞，再用TGF-β1刺激，观察RLE-6TN细胞形态的变化以及检测上皮、间质化特征性蛋白的表达，旨在探讨VD对大鼠肺泡上皮细胞间质转化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN细胞（上海拜力生物科技有限公司）。

1.2 主要仪器与试剂

恒温细胞培养箱（江苏荣华有限公司）；GelDOXR全自动凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；Western blot用电泳仪及半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；胎牛血清（中国杭州四季青）；高糖DMEM培养基（武汉博士德生物工程有限公司）；0.25%胰蛋白酶（武汉博士德生物工程有限公司）；Vitamin D（上海生工生物科技有限公司）；ICG001（上海华雅思创生物科技有限公司）；TGF-β1（美国peprotech 公司）；E-钙粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和纤维连接蛋白（Fn）兔抗大鼠一抗（中国南京巴傲得生物科技有限公司）；增强型RIPA蛋白质裂解液及FITC标志的羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 实验分组及处理

1.3.1 RLE-6TN细胞的培养将RLE-6TN细胞置于含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中，于37℃、5%的CO2孵育箱内静置培养，细胞呈铺路石样贴壁生长。

1.3.2 细胞分组及处理将各组细胞按1×105个/ml的密度种到6孔板中，分为正常对照组（A组）、TGF-β1组（B 组）、TGF-β1＋VD 组（C 组）、TGF-β1＋ICG001 组（D 组）、TGF-β1＋VD＋ICG001 组（E 组）。参考文献浓度，先加入 VD（1 μmol/L）[8]或（及）ICG001（5 μmol/L）[9]，24 h 后在培养液中加入 TGF-β1（10 ng/ml）[8]，诱导 48 h后采用Western blot法检测目的蛋白表达。

1.4 观察指标及检测方法

荧光倒置显微镜下观察各组细胞形态学的改变。采用Western blot法检测各组细胞α-SMA、Fn及E-cadherin的表达量。使用增强型RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白质，10%的SDS-PAG分离细胞总蛋白，转至PVDF膜上，一抗1︰1000稀释抗α-SMA、Fn及E-cadherin抗体，二抗1︰6000稀释，超敏ECL化学发光试剂盒曝光，凝胶图像分析系统分析各目的蛋白灰度值，并以内参β-actin标化各样品蛋白条带的灰度数值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，数据进行方差齐性检验后，两样本均数间比较采用t检验，多个样本均数间两两比较采用LSD多重比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞形态学观察

倒置显微镜下，A组细胞贴壁生长，呈铺路石样，连接紧密；B组间隙明显增大，显著梭形变；C组、D组较B组细胞更多地呈铺路石样改变，细胞间隙有所缩小；E组细胞则大多呈铺路石样改变，间隙更小，形态最为接近A组（图1）。

图1 各组细胞形态学改变（荧光倒置显微镜，200×）

2.2 各组细胞α-SMA、Fn及E-cadherin表达量的比较

B、C、D、E 组的 α-SMA、Fn表达量均高于 A 组，而E-cadherin表达量低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 C、D、E 组的 α-SMA、Fn表达量低于 B 组，而E-cadherin表达量高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C、D组的α-SMA、Fn表达量高于E组，而E-cadherin表达量低于E组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 C、D 两组的 α-SMA、Fn及 E-cadherin表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图2、图3）。

图2 各组细胞α-SMA、Fn及E-cadherin的蛋白电泳图

Western blot检测各组细胞E-cadherin、α-SMA及Fn蛋白水平
A：正常组；B 组：TGF-β1；C 组：TGF-β1+VD；D 组：TGF-β1+ICG001；E 组：

图3 各组细胞α-SMA、Fn及E-cadherin的蛋白相对定量

各组细胞E-cadherin/α-SMA及Fn蛋白灰度值
与正常组比较，*P＜0.05；B 组与 C、D、E 组比较，**P＜0.05；E 组与 C、D 组比较，#P＜0.05

3 讨论

气道重塑包括上皮异常增生，气道平滑肌细胞增生、肥大以及细胞外基质沉积等过程[10-11]，其中上皮间质转化在气道重塑的过程中扮演着重要角色。TGF-β1在气道重塑过程中发挥着核心效应分子的作用[12]，其作用的途径包括β-catenin、经典的Smad和非Smad通路等，其中β-catenin通路与疾病的纤维化形成密切相关[13]。TGF-β1刺激破坏细胞间的紧密连接，诱导β-catenin从上皮细胞接触中解离，使β-catenin的降解减少，从而核内β-catenin/TGF结合增多，促进成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞分化及上皮间质转化[14-15]。

前期研究发现，肾小管上皮细胞中转染F-TrCPEcad质粒，靶向降解胞浆β-catenin蛋白，或采用ICG001特异性地阻断β-catenin的转录活性，结果均显示其可以明显抑制TGF-β1诱导的间质转化[3]。研究显示，VD缺乏在成人及儿童（5～13岁）哮喘患者中普遍存在，在重症及未控制患者中尤为显著，而低水平血清VD（＜50 nmol/L）会增加青少年及成人患哮喘的风险，且VD缺乏与气流受限有关[16-18]。对心肌细胞的研究显示，补充VD可以使Wnt11和CK1蛋白表达增高，负向调控Wnt/β-catenin信号通路，达到抑制心肌细胞增殖、分化及重塑的效果[7]，但VD是否通过β-catenin信号通路来调控TGF-β1诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化尚未见报道。

本实验采用VD或（及）ICG001预处理RLE-6TN细胞，后用TGF-β1刺激，研究观察对RLE-6TN细胞间质转化的影响。镜下TGF-β1刺激组细胞形态上明显呈现间质细胞的特征，显著梭形变，间隙明显增大。但单用VD或ICG001预处理组细胞较TGF-β1刺激组则更多地呈铺路石样改变，细胞间隙有所变小，而VD+ICG001预处理组尤为明显，接近正常组，细胞连接最为紧密，提示VD或（及）ICG001干预可以抑制RLE-6TN细胞的间质转化。采用Western blot检测相关蛋白发现，VD能够降低TGF-β1刺激组细胞的间叶细胞标志物α-SMA以及细胞外基质纤粘蛋白Fn的表达，同时上调上皮标志物E-cadherin的表达，预处理组中VD+ICG001（E组）比单用VD（C组）或ICG001（D组）的效果更明显，结果均具有统计学意义（P＜0.05）。上述结果提示VD能够抑制TGF-β1诱导下RLE-6TN细胞的上皮间质转化，从而对纤维化形成产生影响。

综上所述，本实验结果显示VD能够抑制TGF-β1诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化，同时VD与ICG001联合干预显示出更强的抑制大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞间质化的作用。其机制可能在于VD负向调控Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制β-catenin/TGF启动下游靶基因转录，与ICG001发挥协同作用，起到抗纤维化的效应。其具体机制有待进一步研究，能够为临床探索改善气道重塑性疾病的药物治疗提供新思路。

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