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足细胞（肾小球脏层上皮细胞，podocyte）作为肾小球的滤过屏障的重要组成部分，在多种因素的刺激下可导致其损伤，从而引起蛋白尿的发生和肾小球的硬化[1]。血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ），作为肾脏局部肾系血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的主要效应因子，在间充质干细胞、小鼠和人足细胞等多种细胞中能诱导血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达上调，p-38、Akt、ERK 可能发挥着重要作用[2-5]。但AngⅡ与VEGF在人足细胞中的作用机制仍有许多不明之处还需进一步研究。

Liu等[6]的研究发现一条和炎症相关的新信号通路介导足细胞损伤，即肿瘤坏死因子家族的核因子κB受体活化因子（receptor activator for nuclear factorκB，RANK）信号，RNAK 的配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）可以阻抑凋亡，保护足细胞。前期实验已发现AngⅡ可以通过p38MAPK信号通路诱导足细胞表达VEGF[7]，推测在人肾小球足细胞中是否也存在类似AngⅡ-RANK/RANKLVEGF的通路，调节足细胞的功能，故本实验拟对AngⅡ诱导足细胞表达VEGF的变化及其与RANK/RANKL信号通路的关系进行研究，以进一步明确AngⅡ诱导足细胞表达VEGF的作用机制及其对足细胞的保护作用，为将来药物干预提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；1%ITS（胰岛素 10 μg/ml、转铁蛋白 5.5 μg/ml、亚硒酸钠 5 ng/ml，美国 Sigma 公司）；青霉素（华北制药）；AngⅡ （美国 Sigma公司）；RANKL（美国 R&D Systems公司）；Trizol液（美国 Promega公司）；引物（上海生工公司）；RNA提取试剂盒（美国Omega公司）；反转录试剂盒（Prie ScriptTMRT-PCR kit，宝生物工程有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（宝生物工程有限公司）；实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）。

1.2 足细胞培养

人肾小球足细胞由英国Bristol大学Saleem教授赠送，按参考文献[8]的方法培养。足细胞复苏后在含1%ITS的RPMI-1640培养液（10%胎牛血清）中，于33℃ 、5%CO2培养箱中培养，用含0.05%胰蛋白酶的消化液消化传代，然后转入37℃、5%CO2培养箱分化14 d。选取在37℃条件下分化为树枝状的人肾足细胞为研究对象。

1.3 实验分组

AngⅡ浓度梯度对人肾小球足细胞表达基因VEGF、RANK和RANKL的影响：细胞各组中分别加入 AngⅡ，其终浓度分别为 0、1、10、100 nmol/L，培养24 h后收集细胞。AngⅡ时间梯度对人足细胞VEGF、RANK和RANKL基因表达的影响：用100 nmol/L AngⅡ影响VEGF基因表达的最佳浓度干预细胞，分别培养 0、6、12、24 h。RANKL 对 AngⅡ诱导人肾小球足细胞表达VEGF的影响：用AngⅡ（100 nmol/L）加入不同剂量的 RANKL（0、20、40、80 ng/ml）干预足细胞24 h，同时设置正常组（不加AngⅡ和RANKL）。

1.4 RNA提取和半定量RT-PCR

用Trizol法提取总RNA进行RT-PCR检测，以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCT法进行相对定量。严格按照RT-PCR相关试剂盒说明书进行操作，提取RNA，逆转录成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒在Roche 480仪器上进行PCR检测。PCR反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60 ℃ 20 s（35 cycles）。各基因引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.5 AngⅡ和RANKL干预对足细胞凋亡率的影响

实验分三组：分别以100 nmol/L的AngⅡ单独刺激足细胞，100 nmol/L的AngⅡ和80 ng/ml的 RANKL共同处理足细胞24 h，同时设置空白对照组。胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，使用凋亡检测试剂盒进行FITC和PI双染15 min，30 min内通过流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0软件分析数据，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，采用单因素方差分析（one-way AVONA）和Turkey检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量AngⅡ对人肾足细胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表达水平的影响

RT-PCR检测结果显示，以不同浓度AngⅡ刺激肾足细胞24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表达均呈剂量依赖性升高。如图1所示，与空白组比较，较大剂量组（10、100 nmol/L AngⅡ）的 VEGF、RANK和RANKL mRNA表达量明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 不同浓度的AngⅡ对足细胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表达的影响

2.2 AngⅡ刺激不同时间对人肾足细胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表达水平的影响

在 AngⅡ（100 nmol/L）刺激肾足细胞 0、6、12、24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表达均呈时间依赖性升高。与对照组（0 h）比较，VEGF、RANK和RANKL mRNA表达量均随干预时间增加而呈现明显的上升趋势（P＜0.05）（图 2）。

图2 AngⅡ刺激时间对足细胞表达VEGF、RANK和RANKL mRNA的影响

2.3 RANKL对经AngⅡ诱导的足细胞表达VEGF的影响

与空白组比较，经AngⅡ100 nmol/L刺激，不添加RANKL的对照组的VEGF mRNA表达增加（P＜0.01）。经RANKL干预的足细胞，VEGF mRNA的表达受到抑制，且呈现剂量依赖性抑制。小剂量组（20 ng/ml）与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。但随着RANKL剂量的增大，VEGF mRNA 表达明显下调（P＜0.05）（图 3），提示在AngⅡ诱导的足细胞中，RANKL影响mRNA的表达，与VEGF mRNA的表达成负相关。

2.4 AngⅡ和RANKL干预对足细胞凋亡率的影响

收集细胞，使用BD Accuri C6流式细胞仪进行细胞凋亡率检测，并进行方差分析。与空白组（0.4±0.1）%比较，对照组（AngⅡ 100 nmol/L）的凋亡率为（28.34±2.2）%，说明AngⅡ可以明显诱导足细胞凋亡。AngⅡ+RANKL 组的细胞凋亡率为（11.14±1.06）%，与 AngⅡ比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 4），提示RANKL可以抑制AngⅡ诱导的足细胞凋亡。

图3 RANKL对经AngⅡ刺激的足细胞VEGF mRNA表达的影响

图4 不同处理组的细胞凋亡率变化

3 讨论

蛋白尿是几乎所有肾小球疾病的共同临床表现之一，它不仅是肾小球滤过屏障受损的标志，而且它与肾小球疾病的进展密切相关，是肾小球疾病进展的独立危险因素。足细胞是附着在肾小球基底膜（GBM）外侧高度分化的细胞[9]，作为肾小球固有细胞之一，连同GBM和毛细血管内皮细胞一起，构成肾小球血液滤过屏障[10]。作为血液滤过的最后屏障，足细胞已经成为针对蛋白尿研究的关键细胞。目前大量研究认为，足细胞损伤是肾小球损伤的中心环节，可以直接导致蛋白尿的发生及肾小球的硬化。因此，研究足细胞从而揭示蛋白尿发生的机制具有重要意义。

VEGF是一种二聚体糖蛋白，是内皮特异性的有丝分裂原，在肾脏主要表达于足细胞的足突，有增加血管通透性、促进内皮细胞增生和血管形成作用。而VEGF受体则以跨膜蛋白的形式表达于肾小球内皮细胞表面，足细胞可以通过旁表达的方式调节内皮功能，是内皮细胞重要的调控因子[11]。肾小球足细胞和内皮细胞是构成滤过膜的重要成分，VEGF能减少GBM阴离子数而影响电荷屏障，并通过影响肾小球内皮细胞而调节机械屏障，因而VEGF被认为是调节肾小球通透性的重要因子，在肾病进展中扮演着重要的角色[12]。大量证据表明，VEGF与蛋白尿的形成密切相关[13]，VEGF的异常表达增加可导致肾小球滤过膜通透性增加，促进蛋白尿的形成。

肾脏局部的RAS在慢性肾脏病变的发生发展中的重要作用越来越受到人们的关注，RAS的主要效应因子AngⅡ与许多肾脏疾病的发展过程密切相关[14-15]。研究表明，AngⅡ可以诱导肾脏内生性VEGF的产生[5]。此外，Ren等[16]的研究发现，AngⅡ以剂量依赖方式诱导培养的足细胞以及动物模型足细胞凋亡。本研究也发现，AngⅡ可以诱导足细胞凋亡，但是过量的RANKL会抑制AngⅡ诱导的足细胞凋亡。足细胞作为血液滤过的最后屏障，其凋亡必然会增加肾小球滤过膜的通透性，引起蛋白尿的形成。因此，维持VEGF正常水平和足细胞的数量，可以保护肾小球，避免蛋白尿的发生。

RANK及其RANKL是肿瘤坏死因子（TNF）及其受体超家族的成员。以往对RANK和RANKL的研究主要集中在骨质疏松及骨肿瘤性疾病中。大多数学者认为RANK/RANKL/OPG通路是成骨细胞和破骨细胞之间进行对话的重要信号通路，RANKL结合RANK后通过调控NF-κB和MAPK通路促进破骨细胞的分化与活化引起骨质的破坏 [17]。近年有研究表明，RANK和RANKL参与慢性肾脏疾病的发生与发展。Liu等[6，18]在肾小球硬化性肾病、IgA肾病、膜性肾病等患者肾脏中发现RANK和RANKL的高表达，且RANK特异性表达于足细胞。Chen等[19]体内外研究发现，RANK和 RANKL介导 NF-κB通路和 MAPK通路活化，促进足细胞损伤，加快肾脏疾病的发生与发展。

本研究发现，AngⅡ以时间和剂量依赖性的上调VEGF基因的表达，这与Pupilli等[20]的研究结果类似。此外，AngⅡ还能引起RANK和RANKL基因水平的表达上调。当足细胞中加入过量外源性的RANKL时，VEGF的基因水平表达下调，最终引起足细胞凋亡率减少。上述两方面实验结果说明，RANKL与VEGF存在直接的相互关系，处于同一个通路AngⅡ-RANK/RANKL-VEGF中。当AngⅡ含量升高，刺激足细胞表达过多的VEGF，能导致蛋白尿的发生。而AngⅡ还能引起RANK/RANKL的表达升高。但当RANKL达到一定浓度后，能下调VEGF的表达水平，形成反馈调节。因此，AngⅡ和RANK/RANKL两者通过一定的平衡状态共同调节VEGF的表达，维持肾脏的正常功能。本文的研究提示AngⅡ和RANK/RANKL两者共同维持VEGF表达水平，避免足细胞凋亡，为将来药物干预治疗尿蛋白提供了研究基础。

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