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软骨损伤、退变是骨科的常见疾病，常导致关节疼痛、功能障碍甚至造成残疾[1]。由于软骨组织没有血管、神经及淋巴组织，在损伤、退变后难以自我修复，软骨缺损的修复、再生成为了医学界的亟需解决的难题之一。而近年来组织工程的快速发展为这个问题提供了新的解决思路和方案[2]。

组织工程是再生医学的一个重要领域，自20世纪80年代至今已经过30年的研究、发展。其为由各种先天性畸形、慢性退变和创伤所损害的组织和器官的修复提供了新的希望[3]。组织工程由种子细胞、支架材料、生长因子三个要素构成。由于软骨缺损在临床环境中通常是不规则的，所以可以填充任何形状缺损并与宿主软骨紧密结合的可塑性支架成为了组织工程软骨支架的研究热点[4]。

水凝胶是一类具有三维网络结构的聚合物，在水中能够吸收大量水分而溶胀，并在溶胀之后能够继续保持其原有结构而不被溶解。因其三维网络结构与天然细胞外基质相近；富含水分，利于种子细胞的存活，可在液态时微创注射至体内再形成半固态的胶体从而减少植入创伤等独特优势，已作为一类广泛应用于骨、软骨等各类组织工程的研究中的支架[5]。本文将对不同材料所构建的水凝胶支架在组织工程软骨的应用进展进行介绍。

1 天然来源材料

1.1 透明质酸（HA）

HA是软骨细胞外基质（ECM）的主要成分，以其特有的分子结构和理化性质在机体内发挥多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质、水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等[6]。临床也常用关节腔注射透明质酸以治疗早期骨关节炎。其是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，之间由β-1，3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1，4-配糖键相连。Zhu等[7]通过肼修饰的适应性弹性蛋白样蛋白（ELP-HYD）和醛修饰的透明质酸（HAALD）之间的反应通过动态腙键产生适应性弹性蛋白样蛋白质透明质酸（ELP-HA）水凝胶。将软骨细胞封装在具有不同HA浓度的ELP-HA水凝胶中，发现增加HA浓度导致软骨标记基因表达的剂量依赖性增加和人硫酸盐粘多糖（sGAG）沉积增强，同时最小化不希望的纤维软骨表型。可作为3D支架广泛应用于组织修复。Ha等[8]在6个小型猪每个膝关节的滑车中制造了全厚度的软骨损伤。3周后将人类脐带血源性间充质干细胞（hUCB-MSC）和4%HA水凝胶复合物的混合物移植到右膝上的缺损处。在左膝上以相同方式产生的骨软骨缺损未经治疗作为对照。术后12周处死猪，通过大体和组织学分析评估随后软骨再生的程度。与对照膝相比，移植组的膝关节存在更良好的透明软骨再生。

1.2 壳聚糖

壳聚糖（chitosan）是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到，化学名称为聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-β-D葡萄糖，自然界中来源广泛，其结构与ECM中的糖胺聚糖相似。因为其优异的生物相容性和生物降解性，成为组织工程中有吸引力的生物材料[9]。Martins等[10]通过关节镜在6只马的膝关节表面产生骨软骨缺损，缺损填充了壳聚糖-甘油磷酸（GP）水凝胶。收集处理被去除的软骨碎片作为对照，从组织学、免疫组织化学和蛋白聚糖的代谢标记进行分析。180 d后收集壳聚糖-甘油磷酸水凝胶修复的组织进行分析，未检测到巨噬细胞和多形核细胞，提示无明显炎症。修复组织允许细胞生长，这些细胞能够合成类似于在正常软骨中的Ⅱ型胶原和PG，提示其软骨细胞性质。Choi等[11]通过将Ⅱ型胶原蛋白与可注射蓝光诱导型壳聚糖（MeGC）水凝胶共价共轭，成功地调节了在血清和细胞复杂生物环境中转化生长因子-β1（TGF-β1）的递送。该水凝胶系统通过在体外封装脂肪来源的干细胞来支持软骨细胞外基质的凝结和沉积，提示这些TGF-β1功能化水凝胶系统在复杂的愈合环境中促进软骨再生的能力。

1.3 丝素蛋白

丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量占蚕丝的70%～80%，富含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等多种氨基酸。因其具有良好的机械性能和理化性质，如良好的柔韧性和强度、透气透湿性、缓释性等，经过不同加工方法可加工成纤维、溶液、粉、膜以及凝胶等，并具极佳的生物相容性，被认为是组织工程支架理想的天然生物材料[12]。Yodmuang等[13]使用由丝微纤维和丝素水凝胶制成的丝纤维复合水凝胶支架，模拟天然软骨的胶原纤维和蛋白多糖复合结构，制造了具有天然软骨组织平衡模量的软骨构建体。在该复合水凝胶支架上培养软骨细胞，观察到优良的软骨细胞反应，培养42 d后与空白的丝状水凝胶相比，具有更好的机械稳定性。提示丝素蛋白作为用于软骨组织修复的复合支架材料的功能性。Mirahmadi等[14]加入了切断的丝素纤维和电纺丝素纤维到热敏壳聚糖/甘油磷酸酯水凝胶，通过流变仪和小瓶倾斜法分析水凝胶的凝胶化温度和凝胶化时间。通过单轴压缩、压痕和动态力学分析测定法测量机械表征，然后从新西兰白兔的膝关节获取软骨细胞，在构建体中培养，评估了细胞的增殖、活力及糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）的产生。结果提示，当水凝胶与两层电纺丝素纤维混合时，其机械性能显著增强。细胞种子支架中GAG和胶原Ⅱ型的结果提示支持软骨细胞的生长。

1.4 胶原蛋白

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，是ECM的重要组成成分，其结构为由三条多肽链构成的三股螺旋结构，或称胶原域。因其具有良好的生物降解性，生物相容性好，且具有较低的免疫原性，胶原蛋白海绵、胶原蛋白凝胶均在软骨组织工程研究中得到广泛应用，并被认为是组织工程的标准支架材料[15]。Smeriglio等[16]从全膝关节置换术患者获得的骨关节炎（OA）软骨组织中分离得到正常软骨细胞和OA软骨细胞。观察到可溶性ColⅥ刺激软骨细胞增殖，并且正常及OA软骨细胞以类似的方式对可溶性ColⅥ作出反应。然而，增殖效应仅由可溶性ColⅥ引起，因为在将软骨细胞暴露于固定化的ColⅥ时未观察到增殖。ColⅥ扩增的软骨细胞在3D仿生水凝胶构建体中显示与工程软骨中未处理的软骨细胞相似的潜力。Uto等[17]将移植和宿主基因背景最接近（同源75%）或相同（100%）的小鼠多能干细胞（iPS）嵌入胶原蛋白水凝胶，植入膝关节缺损模型中。在移植8周时，虽然与宿主背景同源性为75%的iPS细胞趋向于形成畸胎瘤，但同源性为100%的iPS细胞表现为联合再生，GFP免疫组化证明移植的iPS细胞负责骨和软骨的修复。

1.5 藻酸盐

藻酸盐是一种来源于褐藻细胞壁的亲水性线性多糖，遇二价阳离子即可发生偶联反应快速形成水凝胶。其来源广泛，成胶反应温和，并具有相对较好的机械性能及良好的生物相容性，且能提供有利于细胞成长、有利于细胞间大分子物质扩散及细胞间信号传到的3D微环境，故成为了组织工程中广泛用于封装种子细胞的支架材料[18]。Xu等[19]开发了非接触共培养模式的组合，将人或兔MSC和兔关节软骨细胞（rAC）封装在3D藻酸盐水凝胶珠中或在单层（2D）中培养，随后在Transwell系统中共培养。其后对软骨细胞外基质的细胞形态、生长、沉积和rAC的基因表达进行研究，提示了MSC与rAC之间明确的旁分泌作用，证明MSC可以下调软骨细胞分化及在软骨修复中的作用。

1.6 富血小板血浆（PRP）

PRP，是全血经离心后得到的血小板浓缩物，生物相容性好，如采用自体全血则无免疫原性、无炎症反应等负面影响。其含有大量蛋白质，并含有大量生长因子，如血小板源生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）、血小板源表皮生长因子（PDEGF）、血小板源血管生长因子（PDAF）、胰岛素生长因子-1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）等[20]。因上述优点以及易于获取的特点，在组织工程研究中得到普遍应用。Lee等[21]将原代分离的大鼠软骨细胞在PRP/水凝胶复合材料中培养后，植入大鼠剑突软骨中心圆柱型软骨缺损，术后第7天处死大鼠，并进行组织化学和免疫组化评估。提示剑突软骨细胞在复合水凝胶中增殖良好。在含PRP的水凝胶中，缺损处显示早期于梭形细胞周围形成大量软骨基质，这些结果与蛋白聚糖的Safranin-O染色和Ⅱ型胶原蛋白的免疫组化相一致。体外基因表达分析显示PRP/水凝胶植入物通过显著增加CB1并上调ChM-1抗炎，为透明性软骨再生提供了合适的环境。

2 人工合成材料

2.1 低聚乙二醇富马酸酯（OPF）

OPF水凝胶是由聚乙二醇和延胡索酸酯与聚乙二醇二丙烯酸酯通过化学交联所得，相比其他水凝胶具有更高的含水量，甚至相较一些天然来源材料如明胶、透明质酸等具有更好的组织相容性和生物可降解性[22]，是一种经过深入研究的支架。Hui等[22]在12只8月龄的小型猪建立24处软骨缺损，实验组（n=12）植入再水合的冻干OPF水凝胶支架，对照组无植入物。术后2个月和4个月进行组织学检查，实验组支架本身在2个月和4个月时对新组织填充的比例分别增加了58%和54%，并且透明质酸在4个月时占新组织的39%。提示再水合冻干OPF水凝胶支架在猪软骨缺损模型中增强了透明-纤维软骨混合修复组织的形成。Girolamo等[23]在7只成年小型猪右侧膝关节滑车周边部分建立4处缺损（n=28），在实验组采用种植了自体或人脂肪干细胞（ASCs）的OPF水凝胶复合物填充，对照组单独用OPF水凝胶填充。6个月后在实验组中观察到具有更好的生物力学性质和较高的Ⅱ型胶原蛋白表达的软骨组织。

2.2 聚乙烯醇（PVA）

PVA是一种极安全的高分子有机物，具有良好的生物相容性。PVA水凝胶在眼科、伤口敷料和人工关节方面均有广泛应用。因其具有与关节软骨、半月板相当的粘弹性状，被认为是软骨组织工程中具有吸引力的材料[24]。但相比其他水凝胶，其蛋白吸附量较低，不利于细胞附着。Blum等[25]使用两种不同的凝胶加工技术来制备水凝胶。第一种方法将边界润滑剂官能化聚乙烯醇，然后将聚合物通过物理交联反应形成水凝胶。第二种方法是形成非官能化聚乙烯醇水凝胶，然后在凝胶上进行官能化反应。收集软骨样品，以比较边界润滑剂官能化水凝胶与非官能化水凝胶和天然软骨的机械和摩擦学性能。摩擦实验提示官能化水凝胶的摩擦系数较纯PVA降低了70%。压痕研究了水凝胶的弹性模量，提示水凝胶的稳定性受加工方法的影响，显示边界润滑剂官能化PVA水凝胶作为仿生合成关节软骨替代物的潜力。

人工合成材料种类繁多，其他如降冰片烯、聚乳酸(PLA)、聚 L-丙交酯-己内酯（PLCL）等相对应用较少，文中不再赘述。

3 问题与展望

软骨损伤是骨科常见的疾病，目前常用的药物、手术等治疗手段都难以促进软骨的再生修复，因此通过组织工程技术修复软骨损伤成为了研究的热点。其中，组织工程软骨支架，尤其是能够根据缺损形状塑形的水凝胶支架的制备成为了研究的重点。随着材料学不断发展，用于构建组织工程软骨支架的材料种类繁多，单一的材料由于自身理化特性的局限难以单独进行构建，故目前的研究多采用多种材料构建的复合支架以取长补短，经过多年的研究与应用，组织工程软骨水凝胶支架在体内及体外实验均已取得可观的成果，但仍存在着种种难题需要进一步研究以期得到解决，如何提高和保持支架材料力学性能及表面活性，尤其是在体内动态的力学环境内；如何控制支架的降解速度与软骨修复速度的平衡，以及支架在体内降解产物对机体的影响；如何使再生的软骨组织与基底骨组织达到正常的过渡以及与周围原有软骨组织的长合；如何降低同种异体组织来源甚至异种组织来源的材料的免疫原性、炎症反应以及如何有效地灭菌以降低感染、传染性疾病传播的风险。

尽管面临诸多困难，但通过探索新型材料的应用以及进一步研究现有材料通过不同复合方式、复合比例及不同的交联方法，并且通过3D打印等制备技术的应用，仍有望得到更为符合人体软骨天然结构及功能的水凝胶支架，实现组织工程软骨的临床应用，为软骨损伤患者带去希望。

[参考文献]

[1]Spiller KL，Maher SA，Lowman AM.Hydrogels for the repair of articular cartilage defects[J].Tissue Eng Part B Rev，2011，17（4）：281-299.

[2]Xiao Y，Friis EA，Gehrke SH，et al.Mechanical testing of hydrogels in cartilage tissue engineering：beyond the compressive modulus[J].Tissue Eng Part B Rev，2013，19（5）：403-412.

[3]Vinatier C，Guicheux J，Daculsi G，et al.Cartilage and bone tissue engineering using hydrogels[J].Biomed Mater Eng，2006，16（4 Suppl）：S107-S113.

[4]Meng Q，Man Z，Dai L，et al.A composite scaffold of MSC affinity peptide-modified demineralized bone matrix particles and chitosan hydrogel for cartilage regeneration[J].Sci Rep，2015，5：17802.

[5]Amini AA，Nair LS.Injectable hydrogels for bone and cartilage repair[J].Biomed Mater，2012，7（2）：024105.

[6]Kim IL，Mauck RL，Burdick JA.Hydrogel design for cartilage tissue engineering：a case study with hyaluronic acid[J].Biomaterials，2011，32（34）：8771-8782.

[7]Zhu D，Wang H，Trinh P，et al.Elastin-like protein-hyaluronic acid （ELP-HA）hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration[J].Biomaterials，2017，127：132-140.

[8]Ha CW，Park YB，Chung JY，et al.Cartilage repair using composites of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and hyaluronic acid hydrogel in a minipig model[J].Stem Cells Transl Med，2015，4（9）：1044-1051.

[9]Man Z，Hu X，Liu Z，et al.Transplantation of allogenic chondrocytes with chitosan hydrogel-demineralized bone matrix hybrid scaffold to repair rabbit cartilage injury[J].Biomaterials，2016，108：157-167.

[10]Martins EA，Michelacci YM，Baccarin RY，et al.Evaluation of chitosan-GP hydrogel biocompatibility in osteochondral defects：an experimental approach[J].BMC Vet Res，2014，10：197.

[11]Choi B，Kim S，Fan J，et al.Covalently conjugated transforming growth factor-β1 in modular chitosan hydrogels for the effective treatment of articular cartilage defects[J].Biomater Sci，2015，3（5）：742-752.

[12]Silva SS，Motta A，Rodrigues MT，et al.Novel genipin-crosslinked chitosan/silk fibroin sponges for cartilage engineering strategies[J].Biomacromolecules，2008，9（10）：2764-2774.

[13]Yodmuang S，McNamara SL，Nover AB，et al.Silk microfiberreinforced silk hydrogel composites for functional cartilage tissue repair[J].Acta Biomater，2015，11：27-36.

[14]Mirahmadi F，Tafazzoli-Shadpour M，Shokrgozar MA，et al.Enhanced mechanical properties of thermosensitive chitosan hydrogel by silk fibers for cartilage tissue engineering[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2013，33（8）：4786-4794.

[15]Zheng L，Sun J，Chen X，et al.In vivo cartilage engineering withcollagenhydrogelandallogenouschondrocytes after diffusion chamber implantation in immunocompetent host[J].Tissue Eng Part A，2009，15（8）：2145-2153.

[16]Smeriglio P，Dhulipala L，Lai JH，et al.Collagen Ⅵ enhances cartilage tissue generation by stimulating chondrocyte proliferation[J].Tissue Eng Part A，2015，21（3-4）：840-849.

[17]Uto S，Nishizawa S，Takasawa Y，et al.Bone and cartilage repair by transplantation of induced pluripotent stem cells in murine joint defect model[J].Biomed Res，2013，34（6）：281-288.

[18]Lee M，Siu RK，Ting K，et al.Effect of Nell-1 delivery on chondrocyte proliferation and cartilaginous extracellular matrix deposition[J].Tissue Eng Part A，2010，16（5）：1791-1800.

[19]Xu L，Wang Q，Xu F，et al.Mesenchymal stem cells downregulate articular chondrocyte differentiation in noncontact coculture systems：implications in cartilage tissue regeneration[J].Stem Cells Dev，2013，22（11）：1657-1669.

[20]Lee HR，Park KM，Joung YK，et al.Platelet-rich plasma loaded hydrogel scaffold enhances chondrogenic differentiation and maturation with up-regulation of CB1 and CB2[J].J Control Release，2012，159（3）：332-337.

[21]Lee HR，Park KM，Joung YK，et al.Platelet-rich plasma loaded in situ-formed hydrogel enhances hyaline cartilage regeneration by CB1 upregulation[J].J Biomed Mater Res A，2012，100（11）：3099-3107.

[22]Hui JH，Ren X，Afizah MH，et al.Oligo[poly（ethylene glycol）fumarate]hydrogel enhances osteochondral repair in porcine femoral condyle defects[J].Clin Orthop Relat Res，2013，471（4）：1174-1185.

[23]de Girolamo L，Niada S，Arrigoni E，et al.Repair of osteochondral defects in the minipig model by OPF hydrogel loaded with adipose-derived mesenchymal stem cells[J].Regen Med，2015，10（2）：135-151.

[24]Stocco E，Barbon S，Dalzoppo D，et al.Tailored PVA/ECM scaffolds for cartilage regeneration[J].Biomed Res Int，2014，2014：762189.

[25]Blum MM，Ovaert TC.Low friction hydrogel for articular cartilage repair：evaluation of mechanical and tribological properties in comparison with natural cartilage tissue[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2013，33（7）：4377-4383.