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黄芪护肝胶囊是临床常用的保肝药物，是由多种中药组成的复方制剂，其中包括赤芍、丹参、延胡索、大黄、陈皮等主要有效成分，用于慢性肝炎以及药物性肝损伤等疾病的治疗，其药理作用复杂，如延胡索具有行气、止痛、活血作用，其有效成分延胡索乙素具有镇痛、催眠、降低冠脉阻力及增加血疫调节等作用[3]；五味子具有补肾宁心、抗衰老等作用[4]；丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈止痛的作用；丹参酮ⅡA具有保护心血管、抗肿瘤、抗氧化等作用[5]；大黄具有利湿泻下、清热泻火等作用[6]，黄芪护肝胶囊的药理药效与其中中药组分的活性成分密切相关。本研究就黄芪护肝胶囊中延胡索、赤芍、五味子、陈皮以及丹参和大黄中的有效药理成分含量的测定方法进行研究。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

二极管阵列检测器（SPD-M20A型，日本岛津公司），高效液相色谱仪（LC-20AD型，日本岛津公司），LC solution色谱工作站（日本岛津公司），电子天平（十万分之一级，瑞士梅特勒公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110736-201337），延胡索乙素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110726-201414），橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110721-201115），五味子醇甲对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110857-201211），自制黄芪护肝胶囊（批号为 20141010、20140912、20141020）。大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110756-200110），丹参酮ⅡA 对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110766-200619），大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110796-200716），其他试剂为分析纯和纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CNW Athena C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）采用梯度洗脱（0～10 min，A 33%；10～20 min，A 33%～65%；20～30 min，A 65%；30～35 min，A 65%～78%；35～50 min，A 78%；50～55 min，A 78%～85%；55～60 min，A 85%；60～70 min，A 85%～33%）；大黄素、丹参酮ⅡA、大黄酚检测波长为265 nm；延胡索乙素检测波长为210 nm，芍药苷、五味子醇甲和橙皮苷检测波长为230 nm，进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃。延胡索乙素、大黄酚、芍药苷、大黄素、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA理论塔板数均≥5000，分离度均＞1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品储备液和对照品溶液精密称取适量7种对照品，分别采用甲醇溶液制成质量浓度为126、703、363、211、198、310、228 μg/ml的对照品储备液备用。然后精密适量量取各种储备液，加甲醇制成含延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素、大黄酚分别为 12.6、70.3、72.6、42.2、19.8、31.0、22.8 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液黄芪护肝胶囊研磨成均匀细末，采用电子天平称取粉末1 g，锥形瓶内加入25 ml甲醇溶液及1 g黄芪护肝胶囊粉末，称重后在功率频率50 KHz、300 W条件下进行超声震荡处理30 min，冷却后采用甲醛溶液补重，应用0.45 μm微孔滤膜进行过滤。

2.2.3阴性对照溶液按照“2.2.1”中对照品溶液制备过程，分别制备不含有陈皮、延胡索、丹参、赤芍、延胡索和大黄单品的阴性对照溶液。

2.3 空白试验

适量供试品、对照品及阴性对照溶液注入LC-20AD型高效液相色谱仪，参数设置如下。进样量：10 μl；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃。记录色谱图，分析检测效果。结果显示，供试品中延胡索乙素、五味子醇甲、橙皮苷、大黄素、大黄酚、芍药苷、丹参酮ⅡA色谱峰保留时间与对照品一致，阴性对照溶液在相应对照品溶液相同保留时间处无干扰峰出现，提示黄芪护肝胶囊中延胡索、赤芍、五味子、陈皮以及丹参和大黄以外的其他中药组分对测定结果无干扰。HPLC图谱见图1～8。

图1 对照品HPLC色谱图

图2 样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图3 缺延胡索阴性对照样品HPLC色谱图

2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图4 缺赤芍阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图5 缺陈皮阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图6 缺五味子阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；5.丹参酮ⅡA；6.大黄素；7.大黄酚

图7 缺丹参阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；6.大黄素；7.大黄酚

图8 缺大黄阴性对照样品HPLC色谱图

1.延胡索乙素；2.芍药苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹参酮ⅡA

2.4 线性关系考察

分别精密吸取延胡索乙素、芍药苷、大黄素、大黄酚橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA，对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml，加甲醇溶液稀释至 10 ml，配置成梯度浓度的混合对照品溶液，进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃条件下分别进样检测，记录色谱图。以浓度C（μg/ml）对峰面积A进行线性回归，延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚的回归方程分别为：A=4.295×104C+1.374×103（r=0.9996）、A=3.547×104C+3.584×103（r=0.9998）、A=2.236×104C+3.750×103（r=0.9997）、A=6.140×104C+3.366×103（r=0.9994）、A=4.119×104C+2.794×103（r=0.9995）、A=2.155×104C+3.462×103（r=0.9996）和A=3.447×104C+1.863×103（r=0.9995）。橙皮苷、延胡索乙素、芍药苷、丹参酮ⅡA、五味子醇甲、大黄酚、大黄素的线性范围分别为3.63～72.60、1.26～25.20、7.03～140.60、1.98～39.60、2.11～42.20、2.28～45.60、3.10～62.00 μg/ml。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃，连续进样 6 次，考察精密度。延胡索乙素、五味子醇甲、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为0.5%、0.6%、0.4%、0.7%、0.6%、0.5%和0.8%。

2.6 重复性实验

按“2.2.2”项下，平行制备同一样品（批号：20140912）6份，依法进行测定，并分别计算含量，延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚的RSD分别为1.0%、0.6%、1.1%、0.8%、0.7%、1.0%和1.1%。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液分别在 0、2、4、6、8、10、12 h 依次进行测定，延胡索乙素、芍药苷、五味子醇甲、橙皮苷、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为0.8%、0.6%、0.8%、0.7%、1.0%、1.0%和1.2%。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：20140912）0.5g，共6份，分别精密加入延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚峰对照品贮备液1.0 ml，按照“2.2.2”步骤制成供试液，依次进行加样测定，计算各样品回收率，结果见表1。

2.9 样品测定

取3批黄芪护肝胶囊样品，按“2.2.2”步骤配制供试品溶液，进样量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱温：30℃进样检测，记录色谱图，用外标法分别计算样品中延胡索乙素、五味子醇甲、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素、大黄酚含量（表2）。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

黄芪护肝胶囊是中药复方制剂，其中主要的重要组分有18种，赤芍、丹参、延胡索、大黄、陈皮等是主要的药效成分，其中活性成分的含量对药理药效的发挥具有重要作用，而对于其中主要药理成分的检测是进行质控的方法之一，其中延胡索乙素、芍药苷、丹参酮ⅡA、橙皮苷、大黄素、五味子醇甲、大黄酚等是具有活性的主要药理成分。为了能够同时对其采用高效液相色谱法进行检测，选择能够适合多种组分的检测波长具有重要作用，如橙皮苷在207 nm和283 nm具有特征性的吸收峰，而在波长230 nm时候延胡索乙素的吸收峰最强，在217 nm波长条件下五味子醇甲的吸收峰最大，而在230 nm波长时五味子醇甲的吸收峰也较强，而且分离度好，灵敏度高，能够取得较好的检测效果，因此以上几种成分检测过程中采用230 nm作为共同的检测波长能够取得较为理想的效果。丹参酮ⅡA在224 nm和268 nm波长处有特征吸收，大黄素在222 nm波长处有最大吸收，且在252、265、289 nm波长处有特征吸收，225 nm和256 nm波长处大黄酚均具有特征性的吸收峰，但265 nm波长处大黄酚也有较强吸收，而且检测效果稳定，灵敏度高，分离度好，无基线飘移，能够取得较好的检测效果，因此对于丹参酮ⅡA、大黄酚和大黄素的共同检测波长确定为265 nm。

表1 回收率试验结果（n=6）

表2 样品含量测定结果（mg/g，n=3）

3.2 流动相的选择

既往的文献研究显示[7-15]，甲醇-磷酸盐溶液、甲醇-水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液及甲醇-0.1%磷酸溶液在检测过程中均可作为流动相。研究结果显示，以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相能够取得较好的分离效果，检测物的吸收峰对称且较为尖锐，吸收峰的形态较为理想，理论搭板数更高。黄芪护肝胶囊中的成分较为复杂，检测物质的性状存在较大的差别[16-20]，为了获取较好的检测效果，使各检测物的色谱峰分离度更好，出峰时间更合理，通过梯度洗脱的方法，对甲醇和0.1%磷酸溶液配比的不断调整，对载液的极性、离子强度等不断优化，使得检测物质均能获得良好的吸收峰，而且无杂质峰形成及干扰，获得较好的效果。

3.3 供试品溶液制备方法的选择

为了考察不同溶剂以及不同方法提取效果，分别采用超声提取和回流提取，并且在提取过程中采用70%甲醇溶液、乙醇溶液和甲醇溶液作为溶剂进行考察，结果显示延胡索乙素、芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹参酮ⅡA、大黄素和大黄酚等7种检测物在甲醇溶液中较为稳定，杂质干扰小，提取效果较好，对不同的提取技术进行比较发现，超声提取的效果比回流提取的效果要好，采用甲醇为溶液、采用超声提取30 min能够获得最好的提取效果。综合评定，采用本研究中的方法测定黄芪护肝胶囊中的7种有效成分重复性好，回收率高，结果准确，而且操作简便，适宜于在黄芪护肝胶囊的质量控制中使用。

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