姜 欣 舒俊俊 舒如明 龚 丹 宴三华 李 莉

南昌大学第三附属医院妇产科，江西南昌 330008

[摘要]目的探讨限制性片段长度多态性聚合酶链反应（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发病机制的关系，为子痫前期的防治提供依据。方法选取2016年5月～2017年6月我院收治的子痫前期患者100例（病例组）、健康孕妇500例（对照组）作为研究对象，进行亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性分析、基因多态性检测，并进行血液生化指标分析，调查基本资料，进行因素分析。结果病例组患者所有测序都获得成功，对照组测序成功498例。两组患者的基因型频率、等位基因频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者的初中及以下文化水平、有计划妊娠、有计划控制饮食与补充营养、增补叶酸、补充过维生素D、营养不良等因素的例数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组患者的APPT低于对照组，Hcy高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。多因素分析采用Logistic回归分析，结果提示，等位基因TT、增补叶酸、孕期有计划的运动成为独立危险因素（P＜0.05），TT型与Hcy、APPT存在显著相关性（P＜0.05）。结论亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子癫前期有关且存在独立作用，可能与其可提高Hcy有关。

子痫前期是人类妊娠期特有疾病，发生率为7%～ 12%，我国平均为9.4%，严重威胁母婴健康，是导致怒因死亡的主要原因之一[1]。子痫前期的病因尚未被阐明，可能与遗传、免疫失衡、血管内皮损失、纤溶系统失衡、氧化应激、胰岛素抵抗等因素有关。叶酸与钙磷代谢、骨矿物化、免疫功能等因素关系密切，有报道显示其与子痫前期关系密切，叶酸缺乏孕妇更容易出现子痫前期[2-3]。故，有理由认为叶酸代谢相关通路的基因及其多态性可能会影响子痫前期发生风险[4-5]。本研究选取我院收治的子痫前期100例、健康孕妇500例作为研究对象，进行亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性分析和基因多态性监测，分析基因多态性是否起到独立作用，尝试分析基因多态性与维生素D、子痫前期之间的关系，现报道如下。

选取2016年5月～2017年6月我院收治的子痫前期患者100例、健康孕妇500例作为研究对象。子痫前期患者100例纳入病例组，年龄（29.4±2.5）岁，孕次（1.9±0.7）次，采血周（14.4±1.2）周。健康孕妇 500 例纳入对照组，年龄（29.0±3.2）岁，孕次（1.8±0.5）次，采血周（14.2±1.5）周。纳入标准：①临床确诊；②年龄18～45岁；③妊娠8～12周确认并建立围生期保健卡对象；④成功分娩；⑤无认知精神障碍，否热重大疾病史。排除标准：①躯体疾病或其他急慢性疾病；②怀孕前恐惧症、强迫症等精神心理疾病；③无法阅读问卷的内容，无法配合调查。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审核及同意，患者均知晓本研究情况并签署知情同意书。

1.2.1 血样采集与其他指标分析 采血前夜22：00禁食，次日晨起8：00采血，采用真空采血法，采集肘部静脉血5 ml，平均分为3份。1份不进行抗凝，先进行血脂监检测，检测患者总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）等指标。同时采用问卷调查方法，在产后调查孕妇的孕期保健情况，包括增补叶酸情况、维生素D补充情况、接触毒害物质情况等。

1.2.2 基因多态性分析 ①提取DNA：采用天根公司提供的DNA，按照说明书进行操作，监测DNA纯度，取1 μl DNA样本，采用紫外分光光度计测定DNA OD260nm/280nm值，在标准范围1.7～2.0内为合格的样本，可进行PCR检查，否则需要重新提取。②PCR-RFLP检测：通过dbSNP数据库确定MTHFR多态位点相关信息，选择内切酶在线分析软件，选择对应限制内切酶，进行 PCR-RFLP 检测，MTHFR（rs4846049），引物序列 F：5′-CCCCTTCAGTCACAAGTAGGTGG-3′，R：5′-CCTCC AGAGCCAGCCTGAGAC-3′，扩增片段长度177 bp。③提取凝胶中的目的DNA，进行PCR产物测序。PCR扩增条件：首先配置Superminx，混匀到反应管中，每管 24 μl，加入 DNA 模版液 1 μl。 PCR 反应体系 总量 50 μl， 内含 10×PCR 缓冲液 2.5 μl，10 mM dNTP 混 合 液 0.5 μl，50 mM MgCl20.8 μl，PrimerF（5 uM）1 μl，PrimerR（5 uM）＝1 μl，DNA 模板液 1 μl，PlatinumR.Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，灭菌蒸馏水补足至 25 μl。PCR 反应条件：94℃预变性 2 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s， 循环30次，72℃终末延伸5 min，4℃保存。④PCR产物鉴定以及测序，2%琼脂凝胶鉴定，采用DNA测序仪进行测序。

比较两组GC通路上不同位点的多态性结果。分析多因素分析中有统计学意义位点多态性是否起到独立作用，起到独立作用的位点多态性在纠正年龄等因素后，是否与维生素D等指标存在相关性[6]。

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，多因素分析采用Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

病例组所有测序都获得成功，溶解浓度0.10～0.25 μg/μl，DNA 分子量＞50 kb， 对照组测序成功498例。两组的基因型频率、等位基因频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 两组患者基因型频率、等位基因频率的比较[n（%）]

 

与对照组比较，*P＜0.05

2.2.1 两组单因素分析

两组的初中及以下文化水平、有计划妊娠、有计划控制饮食与补充营养、增补叶酸、补充过维生素D、营养不良等因素的例数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

2.2.2 两组患者各因素的比较

病例组APPT低于对照组、Hcy高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 3）。

表2 两组单因素分析[n（%）]

表3 两组患者各因素的比较（±s）

 

与对照组比较，*P＜0.05

将以上因素作为自变量，是赋值为2，否赋值为1，基因型频率赋值方法 CC＝1，CT＝2，TT＝3，APPT、叶酸则采用原值赋值，以是否为子痫前期作为因变量，是赋值为2，否赋值为1，采用Logistic回归进行多因素分析。 结果提示，等位基因 TT[OR＝1.26，95%CI（1.54～1.46），P＝0.014]、增补叶酸[OR＝0.67，95%CI（0.42～1.10）]，孕期有计划的运动[OR＝0.47，95%CI（0.48～1.37）]成为独立危险因素（P＜0.05）。

经分析，TT型与Hcy、APPT存在显著相关性（P＜0.05）（表 4）。

表4 TT型与Hcy、APPT的相关性分析

本研究结果提示，子痫前期是多因素共同作用的结果，与基因多态性、孕期保健情况等因素有关[7]。亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发病存在显著相关性，且起到了独立的作用，等位基因TT[OR＝1.26，95%CI（1.54～1.46），P＝0.014]成为独立危险因素 （P＜0.05）。TT型与Hcy、APPT存在显著相关性（P＜0.05）。提示，亚甲基四氢叶酸还原酶基因TT型可能对子痫前期起到促进作用，且可能与其能够抬高HCY、诱导凝血功能紊乱有关[8-10]。有报道显示，亚甲基四氢叶酸还原酶变异型会导致相关通路的阻塞，使血液中的同型半胱氨酸的浓度增加，从而引起血管壁损伤，诱发溶血[11]。同时还可能导致叶酸缺乏，引起一系列不良反应[12]。Meta分析也证实MTHFRC677T基因多态性与妊高症、复发性自然流程有关，提示改基因多态性可能导致不良妊娠结局发生[13-15]。

综上所述，亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子癫前期有关且存在独立作用，可能与其可提高Hcy有关。

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To explore the PCR-RFLP in testing the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and the pathogenesis of pre eclampsia

JIANG Xin SHU Jun-jun SHU Ru-ming GONG Dan YAN San-hua LI Li
Department of Obstetrics and Gynecology,the Third Hospital affiliated to Nanchang University,Jinagxi Province,Nanchang 330008,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,PCR-RFLP)in testing the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and the pathogenesis of pre eclampsia,provide the basis for the prevention and treatment of preeclampsia.Methods100 preeclampsia (the case group)and 500 healthy pregnant women (the control group)from May 2016 to June 2017 treated in our hospital were selected as subjects to conduct polymorphism analysis of methylenetetrahydrofolate reductase gene and detect of gene polymorphism.Blood biochemical indexes were analyzed,basic data was investigated and factors were analyzed.ResultsAll cases were successfully sequenced in the case group,and 498 cases were successfully sequenced in the control group.The genotype frequency and allele frequency of the case group were compared,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The the number of junior high school degree and below level,planned pregnancy,planned to control diet and nutritional supplements,folic acid,vitamin D supplements,the proportion of malnutrition were compared,and the differences were statistically significant(P＜0.05).APPT in the case group was lower than that in control group,and Hcy was higher than that in control group,the differences were statistically significant(P＜0.05).Logistic regression analysis was used for multivariate analysis.The results showed that allele TT,folic acid supplementation and planned exercise during pregnancy were independent risk factors(P＜0.05).There was significant correlation between TT type and Hcy and APPT(P＜0.05).ConclusionMethylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms are associated with preeclampsia and have independent effects,which may be related to the elevation of Hcy.

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）11（b）-0086-04

（收稿日期：2017-08-28 本文编辑：孟庆卿）