王见璋 何志明 黄金凤 李炜霞

广州中医药大学顺德医院病理科，广东佛山 528333

[摘要]目的探讨LASS2及Ki67表达与鼻咽癌复发的相关性及其意义。方法收集我院2011年～2014年的126例鼻咽癌活检标本，其中首发病例77例，复发病例49例。采用免疫组织化学方法检测LASS2及Ki67在126例鼻咽癌活检组织中的表达，分析LASS2及Ki67在两组间的表达差异及其之间的相关性。结果LASS2在复发病例中的阳性率为61.2%，低于首发病例的88.3%，差异有统计学意义（P＜0.001）。Ki67与鼻咽癌复发无显著相关性（P＞0.05），但LASS2表达与Ki67表达相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论LASS2在鼻咽癌复发的病例中呈低表达，检测LASS2蛋白可能有助于提示肿瘤是否容易复发，LASS2在预测鼻咽癌复发中可能具有重要的临床意义。LASS2与Ki67存在负相关，提示LASS2有可能抑制鼻咽癌肿瘤细胞的增殖。

[关键词]鼻咽癌；LASS2；Ki67；复发

鼻咽癌是原发于鼻咽黏膜被覆上皮的恶性肿瘤，是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率高，在广东、广西、福建、湖南等地多发。鼻咽癌起病隐匿，早期不易被发现，但容易出现淋巴结转移或远处转移。鼻咽癌发病机制不明，治疗效果不理想，5年生存率约50%。放射治疗是鼻咽癌最主要的治疗手段，但首程放疗后仍有8.2%～22.0%的复发率[1]。复发鼻咽癌预后较差，其再程放疗的5年生存率为18.7%～36%[2]。鼻咽癌的发生与相关的基因变异有关，文献已经报道了多种基因变异促进了鼻咽癌的发生[3-7]，但目前尚缺乏与鼻咽癌复发相关的基因研究。

LASS2是一种抑癌基因，广泛存在于人体的多种组织中[8]，近年来的研究证实其可能成为一种肿瘤标志物，具有广泛的发展前景。Ki67是一类与细胞周期相关的增殖细胞核抗原，临床研究显示，Ki67与肿瘤的增殖及预后有密切的关系。本文通过检测LASS2蛋白及Ki67在鼻咽癌首发及复发病例中的表达情况，分析LASS2及Ki67在鼻咽癌复发中的作用以及两者之间的相关性，旨在探讨其作为评估鼻咽癌复发指标的可能性。

收集2011年～2014年我院的126例鼻咽癌活检标本，其中首发病例77例，复发病例49例；男性94例，女性 32 例；年龄 20～78 岁，平均（49.67±11.22）岁。 纳入标准：①首发病例活检前均未进行任何鼻咽癌相关治疗；②复发病例复发前均进行规范化治疗，并随访2年以上。

LASS2多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司（按1∶100稀释）；Ki67浓缩型鼠抗人单克隆抗体（按1∶1000稀释）及SP通用型免疫组化试剂盒均购于福州迈新公司。

标本经常规处理后，制作成蜡块。采用免疫组化SP法检测标本中LASS2及Ki67表达的情况，具体操作如下。①组织石蜡切片脱蜡，水化；②自来水冲洗后，以柠檬酸浸泡进行抗原修复，40℃微波修复15 min；③PBS 冲洗 3 次，每次 3 min（3×3 min）；④滴加 3%双氧水于切片上，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；⑤PBS 冲洗（3×3 min）；滴加一抗，室温下孵育 60 min 或 4℃过夜；⑥PBS 冲洗（3×3 min）；⑦滴加二抗，室温下孵育 15 min；⑧PBS 冲洗（3×3 min）；⑨除去PBS，滴加新鲜配制的DAB显色剂显色，约1 min；⑩自来水冲洗终止显色，苏木精复染、在1%盐酸乙醇分化，PBS返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。LASS2结果判读标准参照文献[9]，以鼻咽癌肿瘤细胞胞质及（或）胞核出现棕黄色颗粒为阳性，30%以上的肿瘤细胞着色才视为阳性。Ki67结果以鼻咽癌肿瘤细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，计算阳性细胞所占的比例，按比例划分三个等级，＜10%为1级，10～30%为2级，＞30%为3级。免疫组化染色时所有标本均有设立阳性对照和阴性对照。免疫组化染色结果由2～3位有经验的临床病理医师独立阅片判断。

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

77例首发病例中,LASS2阳性68例，阴性9例，阳性率为88.3%；49例复发病例中，LASS2阳性30例，阴性19例，阳性率为61.2%。复发病例组的LASS2蛋白表达阳性率低于首发病例组，差异有统计学意义（χ2=12.712，P=0.000）（表1）。

表1 LASS2蛋白在鼻咽癌中表达的比较[n（%）]

Spearman相关性分析结果显示，Ki67与鼻咽癌的复发无显著相关性（r=0.086，P=0.341）（表2）。

表2 Ki67与鼻咽癌复发的相关性分析[n（%）]

Spearman相关性分析结果显示，LASS2蛋白表达与增殖指数Ki67呈负相关，差异有统计学意义（r=-0.208，P＜0.05）（表3）。

表3 LASS2蛋白表达与增殖指数Ki67的相关性分析[n（%）]

鼻咽癌是发病率最高的头颈部恶性肿瘤，治疗效果欠佳，复发率高。即使经过合理及规范的综合治疗，部分患者仍难以避免地出现肿瘤复发。临床资料显示，经过规范化的综合及放射治疗后，仍有10%～36%的鼻咽癌患者会出现鼻咽局部复发，其中半数以上发生在治疗后的前3年内[10]。目前，对鼻咽癌复发机制的研究相对不足，因此，临床工作中尚缺乏有意义的生物学指标预测鼻咽癌的复发。

LASS2基因是近年来研究的一种人类新的基因，属于肿瘤抑制基因。LASS2基因编码的蛋白参与细胞凋亡信号通路的调控。该蛋白通过结构相似性的原理，通过结合V-ATPase质子泵的亚基ATP6L，发挥抑制V-ATPase质子泵跨膜转运H+功能的作用，使细胞内H+浓度升高，进而激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用[11-12]。此外，由于抑制了V-ATPase质子泵跨膜转运H+的功能，导致细胞外H+浓度降低，使得对H+高度敏感的蛋白水解酶类的活性被抑制，引起细胞外基质（ECM）降解减少，从而抑制肿瘤的侵袭和转移。

本研究结果显示，LASS2蛋白在鼻咽癌复发病例中的表达阳性率显著低于首发病例组，提示LASS2蛋白表达阴性的鼻咽癌患者因失去了LASS2蛋白对肿瘤细胞生长的调控作用，从而更容易复发。

Ki67是临床病理检查中常用的抗体，与PCNA一样，主要用于判断细胞的增殖活性。该蛋白最初被发现确定为鼠源的核单克隆抗体，是1983年Gerdes等[13]用鼠源单克隆抗体检测一种来自霍奇金淋巴瘤系细胞核抗原时首次发现。Ki67表达在所有活动的细胞周期（G1、S、G2 和有丝分裂期）中，而在 G0 期不表达。临床资料显示，Ki67增殖指数高低与许多肿瘤的分化程度、浸润转移以及预后密切相关，因此，也是恶性肿瘤预后的重要参考指标之一[14-15]。

本研究结果显示，Ki67与鼻咽癌复发无显著相关性，提示鼻咽癌复发似乎与肿瘤细胞增殖活性无明显关系，但Ki67与LASS2蛋白之间存在负相关，这可能与LASS2抑癌基因的作用有关。LASS2通过诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长，因此LASS2阳性的肿瘤细胞增殖指数相对较低。

综上所述，LASS2蛋白参与了对肿瘤细胞凋亡的调控，能够抑制肿瘤细胞的增殖，从而抑制肿瘤的复发，因此，检测LASS2蛋白可能有助于提示肿瘤是否容易复发，LASS2在预测鼻咽癌复发中可能具有重要的临床意义。

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Relationship between the expression of LASS2 and Ki67 with recurrent of nasopharyngeal carcinoma and its significance

WANG Jian-zhang HE Zhi-ming HUANG Jin-fen LI Wei-xia
Department of Pathology,Shunde Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Province,Foshan 528333,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the relationship between LASS2 and Ki67 expression with the recurrent of nasopharyngeal carcinoma(NPC)and its significance.MethodsA total of 126 cases of NPC biopsy specimens in our hospital from 2011 to 2014 were collected,including 77 initial cases and 49 recurrent cases.Immunohistochemical methods were used to detect the expression of LASS2 protein and Ki67 in 126 patients with NPC.The difference between the expression of LASS2 and Ki67 in the two groups and their correlation were analyzed.ResultsThe positive rate of LASS2 in recurrent cases was 61.2%,which was lower than 88.3%of the initial cases,with significant difference(P＜0.001).Ki67 had no significant correlation with the recurrence of NPC(P＞0.05),however,there is a negative correlation between LASS2 expression and Ki67 (P＜0.05).ConclusionLASS2 was low-expressed in the recurrence of NPC.Detection of LASS2 protein may help to prompt tumor recurrence.LASS2 may be a clinically significant biological indicator for predicting the recurrence of NPC.LASS2 is negatively correlated with Ki67.It is suggested that LASS2 may inhibit the proliferation of NPC tumor cells.

[Key words]Nasopharyngealcarcinoma;LASS2;Ki67;Recurrence

[基金项目]广东省佛山市医学类科技攻关项目（2015AB002 613）

[作者简介]王见璋（1980-），女，广东佛山人，硕士，主治医师，研究方向：临床病理

（收稿日期：2017-08-01 本文编辑：祁海文）