胡云华 张 明 梅志亮▲肖祖克

江西省人民医院二部心内科一区，江西南昌 330006

[摘要]目的研究生物素化微细纤维肽修饰IGF-1对心肌梗死兔肌球蛋白基因表达的影响。方法将28只健康的雄性新西兰白兔随机分为对照组、实验组1、实验组2、实验组3，每组7只。对照组开胸但不进行冠状动脉左前降支结扎，实验组1、2、3建立兔心肌梗死模型。建模成功后，实验组1注射生物素化微细纤维肽修饰的IGF-1，实验组2注射未修饰的IGF-1，对照组（未结扎）与实验组3（心肌梗死）注射同等剂量的生理盐水。术后8周，测定心肌肌球蛋白基因表达。结果 与对照组比较，实验组3心肌肌球蛋白基因的表达水平显著降低，实验组1、2心肌肌球蛋白基因的表达水平显著提高（P＜0.05），但实验组1的心肌肌球蛋白基因表达水平又显著高于实验组2（P＜0.05）。结论 急性心肌梗死会减弱兔心肌肌球蛋白的基因表达，IGF-1和生物素化微细纤维肽修饰IGF-1均能改善心肌梗死兔肌球蛋白的表达，但经过生物素化微细纤维肽修饰的IGF-1比单纯IGF-1的效果更优。

[关键词]生物素化微细纤维肽修饰IGF-1；心肌梗死；肌球蛋白；基因表达

近年来，急性心肌梗死的发病率和死亡率日渐提高，甚至已经超过肿瘤性疾病跃居第一，目前主要治疗方式有药物、介入和冠脉搭桥手术以及心脏移植手术，虽然能有效地干预心血管系统的血运状态，但仅是通过缩小心肌梗死的范围，恢复缺血心肌的供血，延缓左室重构改善预后[1]，对疾病的转归意义不大，因此迫切需要建立其他有效的疗法。胰岛素生长因子（IGF-1）是重要的心源性激素，参与整个动脉粥样硬化（AS）形成的过程，对急性心肌梗死的发展有重大的临床意义[2]。本实验采用MichmeIE.Davis所设计的自我组装的微细纤维肽来延长IGF-1的生理活性，比较其与单纯IGF对心肌梗死兔肌球蛋白基因表达的影响，为其在临床上治疗急性心肌梗死提供理论依据。

健康的雄性新西兰白兔28只，体重2.5～3.5 kg（本院动物实验室提供），心电图机（Kohden 92C），DH150型动物呼吸机（常州德社精密仪器有限公司），戊巴比妥钠（北京普博斯生物），青霉素（华北制药股份有限公司），RTPCR引物（北京华大中生科技发展有限公司）；AMV逆转录酶（日本takara），免疫组化abc试剂盒（武汉博士德公司），琼脂糖（美国 promega）PE480热循环仪（广州立诺自动化设备有限公司），Pharma-cia LKB UltroScan XL扫描仪（美国LKB公司）。

28只健康的雄性新西兰白兔，随机分为对照组、实验组1、实验组2、实验组3，每组7只，对照组开胸后用5-0丝线在左冠状动脉前降支根部下方5 mm处穿过，但不进行结扎，实验组1、2、3建立心肌梗死模型。所有白兔术前6～8 h禁饮食，腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 ml/kg）进行麻醉，麻醉后将兔仰卧固定在手术台，胸前区及上腹部备皮，保持自主呼吸，碘伏消毒，铺巾。从胸骨正中剪开胸骨至颈静脉，暴露纵隔和心脏，将心包固定于胸骨，纵行剪开心包，用棉签慢慢抬起心脏，游离第1、2对角支之间的左冠状动脉前降支，用5-0丝线在左冠状动脉前降支根部下方5 mm处结扎[3-6]。术中静脉滴注 50 g/L葡萄糖生理盐水加利多卡因 30 mg/（kg·h），防止发生室颤。 手术完成后耳缘静脉注射给予青霉素80 0000 U，防止发生感染，术后6～8 h记录V1-6的导联心电图，21只大白兔有ST段抬高明确[7]，表明其心肌梗死模型建立成功，手术后2 d开始进食，正常饲养。

建模 3 d后开胸，用微量注射器分4点在梗死心肌周围进行IGF-1植入，实验组1给予生物素化微细纤维肽修饰的 IGF-1 80BPS（200 ng/ml IGF-1），实验组2给予未修饰的IGF-1 80BPS（200 ng/ml IGF-1），对照组和实验组3均给予同等剂量的生理盐水。关胸，经耳缘静脉给予青霉素80 0000 U防止感染，送回笼中正常饲养。

1.2.3.1 总RNA的提取 采用异硫氢酸胍一步法[8]。

1.2.3.2 反转录及PCR反应 肌球蛋白上游引物序列：5′GCA GAC CAT CAA GGA CCT 3'； 下游引物序列：5′GTT GGC CTG TTC CTC CGC 3′，提取心肌组织总RNA，AMV逆转录酶，向得到的总RNA中加入15 μl RT 液，加入 1 μl AMV，混匀，42℃保温 30 min。 取 5 μl反应产物置500 μl薄壁管中，加入20 μl PCR液及80 ng上下游肌球蛋白引物，再加入1 μl Taq酶及适量 石 蜡 油 。 94℃ ，45 s，55℃ ，45 s，72℃ ，1 min， 在PE480热循环仪上进行35个循环。取15 μl产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，结果用Pharma-cia LKB UltroScan XL扫描仪作光密度扫描[7-8]。

采用统计学软件SPSS 11.0分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用 t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

肌球蛋白基因表达结果：对照组为（0.79619±0.11147），实验组 1 为（1.34612±0.21981），实验组 2 为（1.11578±0.22063），实验组 3 为（0.63714±0.22063）。与对照组比较，实验组3的肌球蛋白基因表达显著降低，说明急性心肌梗死会导致心肌细胞中肌球蛋白表达显著降低；实验组1、实验组2肌球蛋白基因表达水平显著提高（P＜0.05），说明IGF-1和生物素化的微细纤维肽修饰的IGF-1均可改善心肌梗死后肌球蛋白的基因表达，但实验组1的肌球蛋白基因表达水平又显著高于实验组2，说明生物素化的微细纤维肽修饰的IGF-1治疗效果优于单纯IGF-1。

 

图1 兔肌球蛋白基因表达结果

IGF-1是一个非常有效的心肌增长和存活因子，存在于人体的许多器官，能促进梗死心肌的血管生成[9]，减轻心肌坏死程度，维持心肌结构，刺激心脏纤维细胞的增生及纤维粘连蛋白基因的转录，从而阻止心室过度扩张[10-13]。但是IGF-1是一种微量蛋白，容易弥散通过组织，使其作用信号过远而不能持续表达[14-15]，为了使IGF-1在局部微环境能达到稳态以发挥最大作用，本实验采用MichmeIE.Davis所设计的自我组装的微细纤维肽来延长IGF-1的作用，自我组装肽是一种寡肽，由交替的亲水性和疏水性的氨基酸组成，在生理性渗透压和pH值环境下可以迅速组装成极小的微细纤维结构，注射到心肌中会形成3D的细胞微孔环境。通过生物素化微细纤维肽的修饰使IGF-1处于稳态，在特定的局部微环境中发挥持久的作用，从而增强肌球蛋白的表达。肌球蛋白活性是决定心肌收缩力大小的一个至关重要的因素，当肌球蛋白活性降低，心肌收缩时对ATP的水解作用减弱，会造成心肌收缩速度减慢，心肌收缩力降低。实验结果表明生物素化微细纤维肽修饰的IGF-1较单纯IGF-1对改善心肌梗死心肌细胞的活性效果更优，这不但优化了IGF-1作用不能持久的缺陷，又增强了IGF-1具备的生物活性，为其以后在临床的应用提供了依据。

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Influence of biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1 on myosin gene expression in rabbits with myocardial infarction

HU Yun-hua ZHANG Ming MEI Zhi-liang▲XIAO Zu-ke
Ward One of Cardiology Department in Second Department,Jiangxi Provincial People′s Hospital,Nanchang 330006,China

[Abstract]Objective To study the influence of biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1 on myosin gene expression in rabbits with myocardial infarction.Methods A total of 28 healthy male New Zealand white rabbits were randomly divided into the control group,experimental group 1,experimental group 2,and experimental group 3,and there were 7 ones in each group.In the control group,rabbits were performed with thoracotomy but without ligation of left anterior descending branch of coronary artery.For experimental group 1,2,and 3,model of myocardial infarction in rabbits was established.After successful modeling,biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1 was injected in the experimental group 1.In the experimental group 2,biotinylated microfibrinopeptide IGF-1 without modification was injected.In the experimental group 3(myocardial infarction)and control group(without ligation),the same dose of normal saline was injected.The gene expression of myosin was determined 8 weeks after surgery.Results Compared with the control group,theexpression level of myosingene in the experimental group 3 was significantly decreased,but in the experimental group 1 and 2,the gene expression level were greatly increased(P＜0.05).The expression level of myosin gene in the experimental group 1 was significantly higher than that in the experimental group 2.Conclusion Acute myocardial infarction will attenuate the gene expression of myosin in rabitts.Both IGF-1 and biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1 can improve gene expression of myosin in rabbits with myocardial infarction,but the effect is better in the latter.

[Key words]Biotinylated microfibrinopeptide modified IGF-1;Myocasrdial infarction;Myosin;Gene expression

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）10（a）-0033-03

▲通讯作者：梅志亮（1981-），男，汉族，硕士

（收稿日期：2017-07-14 本文编辑：许俊琴）