杨永凯1张 帆1▲韦 浩1周晓辉1陈春美2王春华2涂献坤2

1.福建医科大学附属福州市第一医院神经外科，福建福州 350009，2.福建医科大学附属协和医院神经外科，福建福州 350001

[摘要]目的 观察高压氧及Notch信号阻断剂（DAPT）对大鼠颅脑损伤后内源性神经干细胞增殖分化的影响。方法100只成年健康Wistar大鼠随机平均分为假手术组、颅脑损伤组、DAPT{N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-Sphenylglycinet-butylester}组、高压氧组及二甲基亚砜（DMSO）组，应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型，用免疫荧光双标记染色法观察伤后7、14、21 d及28 d大鼠海马区神经干细胞增殖分化。结果 颅脑损伤组、DAPT和高压氧组海马区 BrdU/nestin 双标阳性细胞数，在伤后 7 d 为（14.2±1.3）、（11.4±1.7）个和（22.3±1.5）个，在伤后14 d 为（9.6±0.7）、（6.9±2.1）个和（13.8±1.4）个，在伤后 7 d 较伤后 14 d 明显增多（P＜0.05）；与颅脑损伤组比较，DAPT组在伤后7 d及14 d双标阳性的细胞数明显减少（P＜0.05）；高压氧组在伤后7 d及14 d双标阳性的细胞数明显增多（P＜0.05）。结论 高压氧能促进内源性神经干细胞增殖分化，Notch信号阻断剂抑制了内源性神经干细胞增殖分化。

[关键词]高压氧；颅脑损伤；神经干细胞；Notch通路；增殖分化

急性颅脑损伤是神经外科的常见疾病，其致死率、致残率高，目前治疗颅脑损伤的方法中传统手术及药物的治疗效果仍不尽满意，因此要寻找其它有效的治疗方法。干细胞治疗是目前认为对颅脑损伤患者比较有效的治疗方法。近年来研究发现，内源性神经干细胞终生存在于侧脑室室管膜下区（subventricular zone，SVZ）和海马齿状回（dentate gyrus，DG）等脑内某些特定的区域。脑损伤后可诱导内源性神经干细胞开始增殖、分化来进行修复[1-2]。Urrea等[3]研究表明，脑外伤后海马齿状回内神经干细胞增殖在伤后早期即开始增殖，于2～3 d时达到高峰。但是颅脑损伤后内源性神经干细胞增殖分化能力十分有限，远不能达到临床恢复的要求。因此，研究如何促进内源性神经干细胞增殖分化，将为内源性神经干细胞治疗带来广阔的前景。

高压氧是目前治疗颅脑损伤比较有效的治疗方法,国内大量临床报道也表明高压氧可以降低中枢神经损伤的伤残率和病死率。另外国内潘长福等[4]实验显示小鼠颅脑损伤后海马区Notch1及Hes1 mRNA明显增高，推测认为Notch信号激活可能与伤后神经干细胞增殖分化有关，因此本研究推测高压氧能够通过Notch信号促进颅脑损伤大鼠神经干细胞的增殖与分化。本研究采用大鼠颅脑损伤模型，用高压氧及Notch信号阻断剂DAPT{N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]–Sphenylglycinet-butylester}干预颅脑损伤后大鼠，观察海马区内源性神经干细胞增殖分化情况，为高压氧治疗颅脑损伤提供理论依据。

健康成年雄性清洁级Wistar大鼠100只，鼠龄3～4个月，体重250～300 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物饲养温度20～24℃，12 h后明/暗循环，正常饮食，自由饮水。采用完全随机设计将大鼠分为5个组，分别为假手术组、颅脑损伤组、DAPT组、高压氧组及DMSO溶剂组，每组各20只。

DAPT购自美国Calbiochem公司；DMSO购自美国SIGMA公司；颅脑定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；-80℃低温冰箱 （美国 Thermo公司）；SHC2600/7500-8型医用空气加压氧舱 （上海七零一所杨园高压氧舱有限公司）。

应用Feeney′s自由落体硬膜外撞击方法[5]建立大鼠颅脑损伤模型，具体方法：损伤装置由底板、固定支架、垂直导杆、下落击锤和聚乙烯撞击圆锥组成。撞击圆锥头端直径4 mm，高2.5 mm。用10%水合氯醛（0.4 ml/l00 g体重）腹腔内注射麻醉大鼠后，将其头部固定于立体定向仪上，剪去颅顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线右侧切开头皮，分离骨膜，用磨钻于中线旁2 mm，紧挨冠状缝后开直径5 mm的圆形窗，硬膜保持完整。依据改良神经功能损伤评分（modifiedneurological severity score，mNSS），大鼠中型颅脑损伤的致伤冲击力为400 g·cm，用20 g砝码于20 cm高处通过金属导杆坠落，撞击置于硬膜上的圆锥上致中型颅脑损伤，用骨腊封闭骨窗，缝合头皮，置鼠笼喂养。

mNSS通过运动试验、感觉试验、平衡木试验等反射丧失和不正常运动，综合评价神经系统损伤的严重程度，是目前应用较广泛的脑损伤后神经运动感觉功能的评估方法。其分数越低，表明神经运动感觉功能越接近正常，评分标准参见[6]。应用mNSS评分对大鼠颅脑损伤模型进行鉴定，使大鼠具有相同的颅脑损伤程度，本实验将评分为7～12分的中型颅脑损伤大鼠列为研究对象。

①假手术组：仅切开头皮和颅骨开窗而不致损伤脑组织；②颅脑损伤组：按颅脑损伤模型方法建立；③DAPT 组：DAPT{N-[N-（3，5-Difluorophenacetyl-L-alanyl）]–Sphenylglycinet-butylester}为 γ 分泌酶抑制剂，是特异性的Notch信号阻断剂，溶于二甲基亚砜（DMSO）溶剂中保持稳定，颅脑损伤模型成功后腹腔注射DAPT，每次腹腔注射100 mg/kg体重[7]，隔日注射1次，连续28 d。④高压氧组：大鼠颅脑损伤模型成功后3 h内进行高压氧治疗，先用纯氧充分洗舱10 min后，在20min内匀速加压至2.0ATA（0.2MPa）稳压60min，其间用纯氧通风10 min，舱内氧浓度＞96%。稳压结束后用20 min匀速减压至常压出舱。每天1次，共28 d。⑤DMSO溶剂组：按照与DAPT等体积腹腔注射颅脑损伤大鼠。以上5组根据颅脑损伤后处死动物的时间（颅脑损伤后 7、14、21、28 d）随机分为 4 个亚组，每个亚组5只大鼠。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），是一种嘧啶脱氧核苷类似物，在DNA合成期（S期），代替胸腺嘧啶掺入，标记新生细胞，可判断分化细胞是否来源于神经干细胞（NSCs），各组干预后分别于颅脑损伤后7、14、21 d及28 d处死大鼠，处死前2 d开始腹腔注射BrdU（50 mg/kg）每天2次，每次间隔8 h。取脑标本时行4%多聚甲醛灌流后，再将脑置于4%多聚甲醛中浸置4～6 h后，取海马齿状回脑组织用PBS漂洗，经乙醇常规脱水，二甲苯透明后，浸蜡包埋，连续5 μm厚切片，组织切片按免疫组织化学染色操作步骤完成后使用激光共聚焦显微镜采集试验结果。参照Kuhn等[8-9]方法，计算双标阳性细胞数，每个亚组5只大鼠，每只大鼠取非连续的3张切片，每张切片选取2个视野计数细胞。

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

在激光共聚焦显微镜下观察，在BrdU/nestin荧光染色切片中，可见BrdU阳性细胞由TRITC标记为红色，神经元特异性抗原nestin阳性细胞由FITC标记为绿色，BrdU/nestin阳性双标细胞显示为黄色。检测结果显示，假手术组在伤后各时间点海马区均没有发现BrdU/nestin双标的阳性细胞；在伤后7 d及14 d颅脑损伤组、DAPT组和高压氧组BrdU/nestin双标阳性的细胞数明显增多，与颅脑损伤组比较，高压氧组双标阳性的细胞数明显增多 （P＜0.05），DAPT组双标阳性的细胞数明显减少（P＜0.05），DMSO溶剂组对大鼠海马区神经干细胞增殖影响不大。且颅脑损伤组、DAPT组、高压氧组双标阳性的细胞数在伤后7 d较伤后 14 d 明显增多（P＜0.05）（表1）。

表1 5组大鼠不同时间BrdU/nestin双标阳性细胞数的比较（个，±s）

 

与颅脑损伤组同期比较，aP＜0.05；与本组伤后7 d比较，bP＜0.05

BrdU作为标志物可以标记活跃的增殖细胞，但不能单独反映神经干细胞的增殖，nestin是一个广泛用于识别神经干细胞的标记，免疫荧光BrdU/nestin双标阳性细胞可以反映新增殖的内源性神经干细胞。本实验用高压氧及DAPT干预颅脑损伤大鼠后，与颅脑损伤组比较，在伤后7 d及14 d高压氧组双标阳性的细胞数明显增多，提示高压氧促进大鼠海马区神经干细胞增殖；DAPT组较颅脑损伤组双标阳性的细胞数明显减少，提示DAPT可能抑制大鼠海马区神经干细胞增殖。

临床报道高压氧可以降低中枢神经损伤的伤残率和病死率[10-12]。刘海等[13]研究认为高压氧使大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞增殖、分化加强，脊髓损伤后的神经功能得到改善，提示高压氧的治疗作用可能与激活内源性神经干细胞的增殖有关。王晓莉等[14]研究表明高压氧可以促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的增殖，其机制与Wnt信号活化有关。而Notch信号通路同Wnt信号通路相似，也与神经发生密切相关。

Notch信号通路由 Notch受体、Notch配体和CSLDNA结合蛋白3部分组成，配体与受体结合后，Notch受体相继发生两次蛋白水解。第2次是由γ-分泌酶在跨膜区靠近胞膜内的位点切割蛋白，使具有核定位信号的胞质内区域（NICD）释放人细胞质，进入细胞核与DNA结合蛋白CSL相互作用，导致下游的Hes基因激活，参与神经系统的发生，故Hes 1的表达受Notch信号的调节。DAPT是一种特异性抑制γ-分泌酶活性的化学分子，被公认为Notch信号通路的有效阻断剂，能抑制Notch信号通路，笔者前期的实验中已证实DAPT通过抑制Notch信号通路的活性有抗脑胶质瘤作用[15]。将DAPT运用于神经干细胞的体外培养中，镜下可见神经干细胞数量明显减少，神经干细胞生长过程中所形成的神经球的直径也明显减小；相反的，过表达Notch 1、Hes 1和Hes 5能够促进神经前体细胞的增殖和自我更新[16-17]。本实验中运用DAPT干预颅脑损伤大鼠，DAPT组较颅脑损伤组双标阳性的细胞数明显减少，提示DAPT抑制了大鼠海马区神经干细胞增殖，说明Notch信号通路参与了内源性神经干细胞的增殖分化。

本实验中颅脑损伤组、DAPT组、高压氧组双标阳性的细胞数在伤后7 d较伤后14 d明显增多，提示颅脑损伤大鼠海马区内源性神经干细胞的增殖分化在伤后7 d达到高峰。这与He等[18]的研究结果相一致：大鼠脑缺血损伤后6 h海马区神经干细胞开始表达nestin，伤后7 d后达到高峰，持续时间4周。本研究结果对临床上高压氧治疗时机的启示：对于颅脑损伤的患者高压氧治疗应尽早进行，尽量在伤后7 d内开始高压氧治疗。

综上所述，本研究通过高压氧及Notch信号阻断剂对颅脑损伤后大鼠进行干预，证实高压氧可以通过Notch信号通路调节大鼠颅脑损伤后内源性神经干细胞增殖分化，为今后进一步深入研究Notch信号调控人神经再生机制提供理论基础，为将来临床治疗提供新的靶点。

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The effect of hyperbaric oxygen therapy and Notch signal channel blocker on proliferation and differentiation of neural stem cells in rats with traumatic brain injury

YANG Yong-kai1ZHANG Fan1▲WEI Hao1ZHOU Xiao-hui1CHEN Chun-mei2WANG Chun-hua2TU Xian-kun2
1.Department of Neurosurgery,the First Hospital of Fuzhou City Affiliated to Fujian Medical University,Fujian Province,Fuzhou 350009,China;2.Department of Neurosurgery,Fujian Medical University Union Hospital,Fujian Province,Fuzhou 350001,China

[Abstract]Objective To observe the effects of hyperbaric oxygen therapy and DAPT on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.Methods 100 adult Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,traumatic brain injury group,DAPT group,hyperbaric oxygen therapy group and DMSO group.Animal models of craniocerebral trauma were made using the improved free-fall method in the rats.The proliferation and differentiation of neural stem cells of the DG brain tissue was detected by BrdU labeling fluorescence immunocytochemistry at the 7,14,21 d and 28 d after injury.Results The BrdU and nestin positive cells of the traumatic brain injury group,DAPT group and hyperbaric oxygen therapy group began to increase from the 7 d(14.2±1.3,11.4±1.7,22.3±1.5)to the 14 d after injury(9.6±0.7,6.9±2.1,13.8±1.4).Compared with the 14 d,the BrdU and nestin positive cells significantly increased 7 d after injury(P＜0.05).Compared with the traumatic brain injury group,the BrdU and nestin positive cells significantly decreased in the DAPT group 7 d and 14 d after injury(P＜0.05).Compared with the traumatic brain injury group,the BrdU and nestin positive cells significantly increased in the hyperbaric oxygen therapy group 7 d and 14 d after injury (P＜0.05).Conclusion Hyperbaric oxygen therapy can enhance the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.Notch signal channel blocker can restrain the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.

[Key words]Hyperbaric oxygen;Traumatic brain injury;Neural stem cells;Notch signal channel;Proliferation and differentiation

[中图分类号]R651.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）10（a）-0007-04

[基金项目]福建省自然科学基金资助项目（2015J01498）；福建省福州市卫生计生科研创新团队培育项目（2013-S-wt1）；福建医科大学非直属附属医院科研发展专项课题（FZS 13002Z）

（收稿日期：2017-07-25 本文编辑：任 念）