冯陈慧1彭凡珂1寇力丹1吴逐宇1郭金凤1官 杰2王 慧2▲

1.齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院免疫教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006

[摘要]目的探讨野茼蒿冻干粉对溃疡性结肠炎（UC）大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表达的影响。方法选取健康雄性SD大鼠76只，先随机选出12只大鼠作为空白对照组，其余大鼠用TNBS/乙醇混合液诱导建立UC大鼠模型。造模成功后，所有大鼠每天用不同药物灌胃处理，观察大鼠的疾病活动指数（DAI）。第21天后下腔静脉取血，用ELISA法检测其血清中的细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10含量。结果与模型组和阳性对照组比较，野茼蒿各剂量组促炎因子 IL－6、IL－8、TNF－α 含量不同程度降低（P＜0.01 或 P＜0.05），抗炎因子 IL-10含量不同程度升高（P＜0.01或P＜0.05）。结论野茼蒿冻干粉对UC大鼠的症状有一定的缓解作用，其机制或许与影响 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 的表达有关。

[关键词]溃疡性结肠炎；野茼蒿；促炎细胞因子；抗炎细胞因子

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的发病机制与免疫因素有关。近年来，中医药治疗UC的分子生物学和免疫学研究也取得了一定进展，白头翁汤、黄芩汤、四逆汤、乌梅丸和参苓白术散等中成药能改变UC大鼠血清或结肠组织中细胞因子含量[1]。研究表明，野茼蒿具有抑制肝癌和肺癌及皮肤癌症等功效，调节机体免疫功能的作用[2]。现代临床医学试验证明，野茼蒿可治疗慢性肠胃病和习惯性便秘[3]，但是目前国内外关于野茼蒿的相关研究较少，亦无野茼蒿对UC大鼠血清中相关细胞因子的研究。本实验主要探讨野茼蒿对UC大鼠细胞因子的影响，为野茼蒿对UC的药用价值提供临床依据。

1.1.1 实验动物 76只雄性健康SD大鼠，体重（220±20）g，购于哈尔滨医科大学实验动物学中心，动物合格证号：SCXK（黑）2013001。

1.1.2 药物与试剂 野茼蒿冻干粉：由小组成员于四川盆地采集，挑选光照充裕、长势良好的植株，采集后用清水洗净，自然风干。选取充分干燥的野茼蒿1 kg，用适量蒸馏水浸泡后，再加10倍体积的蒸馏水，煮沸2.5 h，重复3次，合并水煎液，用滤纸将溶液过滤，减压真空浓缩，冷冻干燥形成冻干粉，于-20℃冰箱中保存备用[4]，野茼蒿冻干粉内服成人用量为25～50 g/d，以50 g计算，按成人体重60 kg计算，成人用量大约为0.85 g/kg。大鼠低中高剂量按成人的2、4、8倍换算，则低中高三个剂量组的用量分别为1.7、3.4、6.8 g。所得样品分别溶于2 ml双蒸水中备用；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美国 Sigma 公司，批号：109K5008）的50%（体积分数）的乙醇溶液；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20130314）；96孔大鼠IL-6 ELISA 试剂盒（产品编号：YY41731）、IL-8 ELISA 试剂盒（产品编号：YY41716）、IL-10 ELISA 试剂盒（产品编号：YY41736）、TNF-α ELISA（产品编号：YY41721）试剂盒：购于上海源叶生物科技有限公司；柳氮磺胺吡啶（SASP）肠溶片（上海中西三维药业有限公司，批号：31020450），成人用量 2～3 g/d，（按 3 g 计算，以成人体重60 kg估算）成人用量约为0.05 g/kg。则大鼠用量为0.2 g/kg（按成人的4倍换算）将药物用蒸馏水配成200ml的溶液[5]，4℃冰箱保存备用。

1.2.1 UC大鼠造模 先随机选取12只SD大鼠，正常饲养，不做处理，设定为空白对照组，余下的64只SD大鼠全部进行造模处理。先对这64只大鼠禁食不禁水处理24 h，然后用腹腔注射法将10%水合氯醛（0.25ml/100 g）注入大鼠腹腔内对大鼠进行麻醉，腹腔注射时注意将大鼠头朝下，尾部倾斜向上，使体内脏器上移，避免注射器扎到内脏。麻醉成功后，将TNBS/乙醇溶液（100mg/kg TNBS＋50%的乙醇 0.25 ml）溶液缓慢推入大鼠肛门靠里一段距离，让动物保持下腹部上倾状态，捏紧肛门4min，放回笼中，自然清醒[6]。

1.2.2 分组 造模后观察3 d，大鼠死亡2只，再随机挑选2只大鼠处死，将这4只大鼠进行解剖，取其结肠组织，确认模型构造成功。将剩下的UC大鼠随机分为5组：模型组，野茼蒿低剂量组，野茼蒿中剂量组，野茼蒿高剂量组，阳性对照组（SASP组），用苦味酸给各组大鼠进行编号。

1.2.3 给药方法 造模后第3天开始，阳性对照组给予SASP混悬液灌胃0.20 g/㎏；野茼蒿各剂量组分别给予0.85、1.70、3.40 g野茼蒿冻干粉溶液2ml灌胃，空白对照组和模型组给予2 m l生理盐水灌胃，1次/d，连续21 d。

1.2.4 评分 持续观察大鼠体质量变化、大便性状、便血等情况。参照 Marines等[7]所列的标准进行评分，疾病活动指数（DAI）=（体重+大便形态+大便出血）/3。评分标准：无体质量下降、大便性状正常、无便血记为0分；体质量下降1%～5%记为1分；体质量下降5%～10%、半稀便、大便隐血（+）记2分；体质量下降10%～15%记为3分；体质量下降＞15%、稀便、便血记为4分。

1.2.5 取材及测定 各组大鼠最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛溶液（0.3 ml/kg体重）麻醉大鼠，下腔静脉取血5ml，离心后分离血清，用ELISA试剂检测血清 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 水平， 检测方法参照说明书，记录结果。

数据采用统计软件SPSS 17.0处理，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

空白对照组DAI值一直保持较低，且波动不大，与空白对照组比较，模型组评分显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，各治疗组评分均明显降低（P＜0.05 或 P＜0.01）（表 1）。

表1 各组 DAI评分的比较（分，±s，n=12）

 

与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

与空白对照组比较，模型组大鼠血清中IL-6，IL-8和 TNF-α 水平上升或显著上升（P＜0.05 或 P＜0.01），IL-10水平显著下降（P＜0.01）；与模型组大鼠比较，野茼蒿中、高剂量组和SASP组大鼠血清IL-6，IL-8和TNF-α 水平下降或显著下降（P＜0.05 或 P＜0.01），IL-10 值上升或显著上升（P＜0.05 或 P＜0.01）（表 2）。

表 2 各组细胞因子的比较（pg/m l，±s，n=12）

 

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

UC是一种结肠和直肠的慢性炎症性疾病，发病机制还不确切，结肠溃疡、黏液脓血便、腹泻等为其主要表现，该病病程长，且容易复发，难以治愈。大部分学者认为，UC的发病与环境、肠道微生物和遗传易感性共同作用相关，这些因素引起肠道免疫功能失常，形成结肠和直肠炎症性病变。慢性UC容易发展成结肠癌，因此受到国内外医学界的广泛关注[8]。

免疫系统（包括免疫细胞、免疫因子及免疫球蛋白）对肠道反应的调节有重要作用，UC的发病涉及T细胞亚群和炎症介质的变化[9]。近年来，研究表明，UC发生与发展的关键性因素就是免疫因素[10]，UC疾病进程中的一个重要环节包括不同细胞因子之间的网络作用[11]。其中，与UC病理过程密切相关的有TNF-α、IL-6、IL-8 等促炎因子[12]和 IL-4、IL-10 等抗炎因子[13]，在UC的整个疾病进程中，促炎因子和抗炎因子的持续失衡起非常重要的作用[14-15]。

本实验结果显示，与空白对照组比较，造模各组不同程度出现精神萎靡、体重减轻、稀便、黏液血便等症状，且促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8水平较高，而IL-10这一抗炎因子水平较低，表明在UC大鼠血清中，促炎因子升高，且升高程度与炎症严重程度成正相关，抗炎因子降低，且降低程度与炎症严重程度成负相关。与模型组比较，各给药组大鼠这些症状持续时间较短，在给药过程中，疾病活动指数不同程度降低，且野茼蒿高剂量组的DAI评分比中低剂量组下降较明显，炎症程度也较轻；TNF-α、IL-6、IL-8水平下降，且剂量越高，下降越明显，IL-10水平上升，剂量越高，上升越多，与模型组比较有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。随着野茼蒿剂量的增加，UC大鼠的炎症状况逐渐得到改善，表明野茼蒿对UC的治疗是有作用的，其机制可能是通过降低血清中促炎细胞因子 IL－6、IL－8、TNF－α 水平， 升高血清中抗炎细胞因子IL－10水平，来减轻UC大鼠的炎症反应，起保护肠黏膜的作用。

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The intervention effect of Crassocephalum crepidioides on pro and antiinflammatory cytokines in serum of ratsw ith ulcerative colitis

FENG Chen-hui1PENG Fan-ke1KOU Li-dan1WU Zhu-yu1GUO Jin-feng1GUAN Jie2WANG Hui2▲
1.School of Medical Technology,Qiqihar Medical University in Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China;2.Immunology Teaching and Research Section,Qiqiharmedical University in Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the influence of freeze dried powder of Crassocephalum crepidioides on the expression of serum cytokines TNF-α,IL-6,IL-8 and IL-10 in ratswith ulcerative colitis(UC).Methods 76 healthymale SD rats were randomly selected.Twelve rats were randomly selected as blank control group.The other rats were induced with TNBS/ethanolmixture to establish UC ratmodel.After successfulmodel,all rats were treated with different drugs every day to observe the disease activity index(DAI).The level of TNF-α,IL-6,IL-8 and IL-10 in the serum weremeasured by ELISA.ResultsCompared with model group and positive control group,the level of proinflammatory cytokines IL-6,IL-8 and TNF-α were decreased in varying degrees(P＜0.01 or P＜0.05),and the level of anti-inflammatory factor IL-10 were increased in varying degrees in different dose group of Crassocephalum crepidioides (P＜0.01 or P＜0.05).ConclusionThe freeze-dried powder of Crassocephalum crepidioides has a certain effect on the symptoms of UC rats.Themechanism may be related to influencing the expression of TNF-α,IL-6,IL-8 and IL-10.

[Key words]Ulcerative colitis;Crassocephalum crepidioides;Proinflammatory cytokines;Antiinflammatory cytokines

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）08（a）-0004-03

（收稿日期：2017-05-05 本文编辑：许俊琴）

[基金项目]黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12531798）；黑龙江省大学生创新创业训练项目（201611230031）；齐齐哈尔医学院大学生课外学术科研课题

▲通讯作者：王慧，女，天津人，硕士，讲师，主要研究方向：中医药治疗炎症性疾病的机制研究