石洪超 杨能英 何风雷 彭富全

广州白云山陈李济药厂有限公司，广东广州 510288

[摘要]目的建立评价更年宁质量的方法。方法采用薄层鉴别（TLC）的方法对更年宁中牡丹皮、白芍、丹参进行薄层定性鉴别。采用高效液相色谱法 （HPLC）测定更年宁中的特征性成分黄芩苷的含量。选用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，流动相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；检测波长为 280 nm。结果在 TLC 色谱图中可以检出牡丹皮、白芍、丹参的特征斑点，且各斑点清晰，易于观察。黄芩苷在92.4～924 ng范围内进样量与其峰面积线性关系良好（r=0.9998）。平均加样回收率为99.79%，RSD为1.33%（n=6）。该方法精密度、重复性和稳定性良好。结论本文建立的方法可提供更年宁的质量评价方法，该方法稳定、准确、无干扰且简便。

[关键词]质量控制；更年宁；薄层鉴别；高效液相色谱法

更年宁由柴胡、黄芩、白芍、墨旱莲、人参、党参、郁金、香附（醋炙）、当归、薄荷、川芎、玄参、茯苓、法半夏、石菖蒲、牡丹皮、陈皮、干姜、白术（麸炒）、丹参、王不留行（炒）、女贞子（酒炙）等22味中药组成。更年宁处方源于《卫生部药品标准》中药成方制剂第六册（标准编号WS3-B-1138-92），功效为疏肝解郁，益气养血，健脾安神[1]。现执行的更年宁标准中只有显微鉴别和墨旱莲的薄层鉴别，无含量测定项目，内容简单，难以评价更年宁的内在质量特性。本文通过实验研究，发现白芍、牡丹皮、丹参的薄层色谱特征性强，斑点清晰，可以列入质量标准，同时增加了高效液相色谱法（HPLC）测定黄芩中黄芩苷的含量测定，以期更好地控制更年宁的质量。

1.1 仪器

高效液相色谱仪型号为Waters 2695；检测器的型号为 Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；Sartorious（CP225D）十万分之一天平，Sartorious（BS110S）万分之一天平。SB-5200DT超声波清洗机（300 W，40 Hz）。 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：110736-201426）、丹参酮ⅡA对照品（批号：110766-200416）、黄芩苷对照品（供含量测定用，批号：110715-200212），来源均为中国药品生物制品检定所。更年宁（10批水蜜丸）及阴性样品均由广州白云山陈李济药厂有限公司提供，乙腈为色谱纯；水为Millipore去离子水；磷酸、乙醇、甲苯、乙酸乙酯和三氯甲烷等试剂均为AR。

2.1 丹参的薄层鉴别试验

更年宁样品供试液的制备：取更年宁样品适量，粉碎成细粉，取约10 g，加三氯甲烷70 ml，超声30 min，过滤，蒸干溶剂，用1.5 ml乙醇将残渣溶解，即得[2-3]。

丹参酮ⅡA对照品供试液的制备：取丹参酮ⅡA对照品约2.5 mg，置5 ml的容量瓶中，加入乙醇溶解，用乙醇稀释至刻度，即得。

丹参阴性对照溶液的制备：按更年宁的制备工艺，去掉丹参药材，制成缺丹参的阴性样品。取该样品适量，粉碎成细粉，按上述更年宁样品供试液的制备方法制备，即得。

检测方法：照薄层色谱方法试验，吸取更年宁样品供试液、丹参酮ⅡA对照品供试液、丹参阴性对照溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯 （19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，日光下观察薄层色谱特征斑点，见图1。

实验结论：更年宁样品色谱中，在与对照品丹参酮ⅡA色谱相对应的地方，都有暗红色的斑点，斑点清晰，在丹参阴性对照色谱中未见，因此丹参阴性对照无干扰，可以列入质量标准。

 

图1 丹参薄层鉴别色谱图

1.丹参阴性对照；2.更年宁样品（批号：20141001）；3、7.丹参酮ⅡA 对照品；4.更年宁样品（批号：20141001）；5.更年宁样品（批号：20141002）；6.更年宁样品（批号：20141003）

2.2 牡丹皮、白芍的薄层鉴别试验

更年宁样品供试液的制备：取更年宁样品适量，粉碎成细粉，取约5.0 g，加入40 ml甲醇，超声提取40 min，过滤，蒸干溶剂，用5 ml甲醇将残渣溶解，即得[4]。

芍药苷对照品供试液的制备：取芍药苷对照品约5 mg，置5 ml的容量瓶中，加入乙醇溶解，用乙醇稀释至刻度，即得。

双阴性（牡丹皮、白芍）供试液的制备：按更年宁的制备工艺，去掉牡丹皮、白芍2味药材，制成它们的双阴性样品。取该样品适量，粉碎成细粉，按上述更年宁样品供试液的制备方法制备，即得。

检测方法：照薄层色谱方法试验，吸取更年宁样品供试液、芍药苷对照品供试液、双阴性（牡丹皮、白芍）供试液各3 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。见图2。

实验结论：更年宁样品色谱中，在与对照品芍药苷色谱相对应的地方，都有蓝色的斑点，斑点清晰，在双阴性（牡丹皮、白芍）色谱中未见。因此牡丹皮、白芍的双阴性无干扰，可以列入质量标准，对本产品的质量控制有一定的意义。

 

图2 牡丹皮、白芍薄层鉴别色谱图

1.牡丹皮、白芍双阴性对照；2.更年宁样品（批号：20141001）；3、7.芍药苷对照品；4.更年宁样品（批号：20141001）；5.更年宁样品（批号：20141002）；6.更年宁样品（批号：20141003）

2.3 黄芩苷的含量测定方法及方法学考察

2.3.1 含量测定方法

更年宁样品供试液制备：取本品适量，粉碎成细粉，取约0.35 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入50 ml 70%乙醇，密塞，精密称定，超声提取（超声频率为40 kHz，超声功率为250 W）30 min，放冷，再次称定重量，以70%乙醇补足重量，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得[5]。

黄芩苷对照品溶液制备：精密称取黄芩苷对照品（60℃减压干燥 4 h）4 mg，置 100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升含黄芩苷40 μg的对照品溶液。

色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；检测波长为280 nm；柱温为30℃；流速为1 ml/min;理论塔板数以黄芩苷峰计≥3000。

测定方法：分别精密吸取黄芩苷对照品溶液与更年宁样品供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3.2 方法学考察

2.3.2.1 专属性 按更年宁的制备工艺，去掉黄芩药材，制成黄芩的阴性样品。取该样品适量，粉碎成细粉，按“2.3.1”项下含量测定方法项下更年宁样品供试液制备方法制备黄芩阴性对照溶液，分别吸取黄芩苷对照品溶液、更年宁样品供试液、黄芩阴性对照溶液各10 μl，依法测定。更年宁样品色谱图中，在与黄芩苷对照品色谱相对应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而黄芩阴性对照品色谱无干扰，表明本法有专属性，可以作为含量测定指标，见图3。

 

图3 专属性实验高效液相色谱图

a.黄芩苷对照品；b.更年宁样品；c.更年宁阴性对照

2.3.2.2 线性关系考察 分别精密吸取黄芩苷对照品母液 （0.0924 mg/ml）1、2、4、6、8、10 ml于 10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度为9.24、18.48、36.96、55.44、73.92、92.4 ng/μl的对照品溶液，分别吸取10 μl注入液相色谱仪，平行进样各两次，以两次峰面积平均值为纵坐标、黄芩苷进样量（ng）为横坐标，绘制黄芩苷标准曲线，其线性回归方程为：Y=3442.8X-35 951（r=0.9998）。结果表明黄芩苷进样量在92.4～924 ng范围内，峰面积与进样量之间的线性关系良好。

2.3.2.3 精密度试验 取同一批更年宁样品（批号：2014 1001），按“2.3.1”项下含量测定方法项下更年宁样品供试液制备方法制备供试液，依次进样6次，依法测定。经测定供试液中的黄芩苷色谱峰面积的标准偏差（RSD）为0.31%，显示该液相色谱具良好的精密度。

2.3.2.4 重复性试验 取更年宁样品（批号：20141001）6份，每份精密称取0.35 g，按“2.3.1”项下含量测定方法项下更年宁样品供试液制备方法制备供试液，依法测定，黄芩苷的含量为3.91 mg/g，RSD为0.22%（n=6），结果显示该方法重复性良好。

2.3.2.5 稳定性 取更年宁样品（批号：20141001），按“2.3.1”项下含量测定方法项下更年宁样品供试液制备方法制备供试液，依次在 0、2、4、6、8、12 h 进样，依法测定，测得黄芩苷的平均峰面积为875481.5，RSD为0.25%（n=6）。结果显示供试液在12 h内具有良好的稳定性。

2.3.2.6 准确度（回收率试验） 取更年宁样品（批号：20141001）6份，每份约0.18 g，精密称定，依次分别每份添加黄芩苷对照品溶液（0.3776 mg/ml）2 ml，按“2.3.1”项下含量测定方法项下更年宁样品供试液制备方法制备供试液，依法测定，依测得数据计算样品回收率，结果见表1。黄芩苷的平均回收率为99.79%，RSD为1.33%（n=6）。

表1 回收率试验测定结果

2.3.2.7 样品含量测定 取更年宁样品10批，按“2.3.1”项下含量测定方法项下更年宁样品供试液制备方法制备供试液，依法测定，按测得数据计算供试液中的黄芩苷含量，结果见表2。

表2 更年宁样品含量测定结果

在薄层鉴别试验中，白芍的薄层鉴别特征斑点主要是芍药苷，对处方中白芍的薄层鉴别进行研究，发现样品中阴性有干扰，经查阅文献资料，处方中白芍和牡丹皮均含有芍药苷，因此，建立了白芍和牡丹皮双阴性的薄层鉴别方法；对处方中的川芎、当归的薄层鉴别进行了研究，分别对川芎、当归的薄层做了比较试验，川芎和当归的单阴性样品有干扰，考虑到川芎和当归本身色谱特征很相似，经常作为双阴性的形式出现，同时考察了缺川芎和当归两味药材双阴性的干扰情况，进一步实验发现更年宁中当归、川芎的双阴性也有干扰[6]；对处方中玄参、干姜、白术、香附、王不留行、郁金和陈皮的薄层鉴别进行了研究，但样品和阴性的色谱特征斑点相似度很高，基本没有区别，表明阴性对照试验有干扰[7-13]；对处方中人参、薄荷、石菖蒲、党参、柴胡和法半夏的薄层鉴别进行了研究，但样品和对照药材的色谱斑点颜色有差异，且Rf值也有偏移，可能由于该处方成分复杂，其它成分干扰影响其斑点的显色和成分的展开[14-19]。

在含量测定研究中，本品处方由22味中药组成，白芍中有效活性成分芍药苷、牡丹皮中有效活性成分丹皮酚，但芍药苷和丹皮酚的阴性有干扰，专属性不好，因此，正文中选择了黄芩作为含量测定对象，以其有效活性成分黄芩苷作为指标成分，建立了黄芩苷的含量测定（高效液相色谱法）。分析方法验证结果表明该测定方法专属、结果准确、重复性好。对样品的提取方法进行了考察，超声提取45 min和回流提取3 h的提取效率接近，考虑到操作的简单、方便，选择超声提取。 在此基础上，对超声时间（30、45、60 min）进行了比较，超声30 min后，样品溶液中的黄芩苷的含量不再增加，说明30 min超声已经完全，故确定样品的超声时间为30 min。

[1]卫生部药典委员会．卫生部药品标准中药成方制剂（WS3-B-1138-92）[Z].第六册，1992：70.

[2]童志远，陈燕，马才敬，等.脑血通片显微及薄层鉴别方法研究[J].西南军医，2016，18（5）：420-422.

[3]伍晓群，李跃辉.丹黄通络丸质量标准研究的研究[J].湖南中医杂志，2016，32（9）：171-173.

[4]曹文利，曹秀莲，王晓亚，等.白芍配方颗粒质量标准的提高研究[J].河北中医药学报，2016，31（3）：46-48.

[5]潘楣.HPLC法测定复方黄芩片中黄芩苷的含量[J].广东药学院学报，2014，21（6）：689-690.

[6]朱冬可，吴佩颖，高崎，等.乳腺消郁颗粒的质量控制[J].中成药，2015，37（6）：1375-1379.

[7]郝博，苏建.益胆片质量标准完善研究[J].中国药事，2014，28（7）：778-782.

[8]张红，孙婷婷，卫向峰，等.参茸健脑胶囊质量标准研究[J].陕西中医，2016，37（9）：1243-1244.

[9]孙露萍，王菊涛.胃炎康颗粒的质量标准研究[J].时珍国医国药，2015，26（4）：891-893.

[10]卢君蓉，李文兵，傅超美，等.香附药材的质量控制方法的探讨[J].中国医院药学杂志，2015，35（5）：389-392.

[11]赵建颖，卢晓梅，李亮亮，等.复方王不留行片的质量标准研究[J].中国药房，2015，26（24）：3426-3428.

[12]崔晓敏，李芳，李凡，等.双参胶囊的质量标准提高研究[J].中国药房，2016，27（2）：1677-1679.

[13]童晓东，陈志军，杨水英，等.益视明目颗粒的质量标准研究[J].现代中药研究与实践，2016，30（1）：42-45.

[14]廖格斯，汪宇，于世龙，等.和胃颗粒质量标准研究[J].实用药物与临床，2016，19（12）：1520-1530.

[15]李勇，沈雪梅，陈慧明，等.银连感冒茶的质量标准研究[J].中国药业，2013，22（19）：31-33.

[16]李养学，曾文雪，陈秋谷，等.远芪口服液质量标准研究[J].江西中医药，2016，47（12）：60-63.

[17]刁娟娟，李小玲，李新霞，等.益肤丸的薄层色谱鉴别[J].中国现代中药，2016，18（10）：1335-1340.

[18]严华，董亚娟，程显隆，等.南柴胡与常见混伪品的鉴别方法研究[J].中国药学杂志，2015，50（2）：109-114.

[19]梁学政，唐勇琛，甄汉深，等.温卫阳胶囊的质量标准研究[J].海峡药学，2015，27（10）：57-60.

Study on establishment of quality control method for Gengnian Ning

SHI Hong-chao YANG Neng-ying HE Feng-leiPENG Fu-quan
Guangzhou Baiyunshan Chenliji Pharmaceutical Factory Co.,Ltd.in Guangdong Province,Guangzhou 510288,China

[Abstract]ObjectiveTo establish the method for the quality control of Gengnian Ning.MethodsMoutan Cortex,Paeoniae Radix Alba,Salvia Miltiorrhiza of Gengnian Ning were identified by thin layer chromatography (TLC).The content of baicalin (characteristic component of Gengnian Ning)was determined by high performance liquid chromatography(HPLC).The ZORBAX Eclipse XDB-C18column （4.6 mm×250 mm，5 μm） was used,the mobile phase was methanolwater-phosphoric acid （47∶53∶0.2）and the detection wavelength was 280 nm.ResultsMoutan Cortex,Paeoniae Radix Alba,Salvia Miltiorrhiza could be detectable by TLC and the spots were clear for observation.In the range of 92.4-924 ng,baicalin showed a good linear relationship between sample size and its peak area (r=0.9998).The average recovery was 99.79%with RSD=1.33% (n=6).The method had good precision,stability and repeatability.ConclusionThe established method is simple,accurate,reliable,reproducible and with strong specificity,which can be used for the quality control of Gengnian Ning.

[Key words]Quality control;Gengnian Ning;Thin layer chromatography;High performance liquid chromatography

[中图分类号]R927.11

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）07（b）-0141-04

（收稿日期：2017-06-28 本文编辑：许俊琴）

[作者简介]石洪超（1966-），男，本科，制药工程师，研究方向：中药制药工艺及标准研究