刘文俊1柴纪严1谢 鑫1吴成举1陈 靖1单德红2▲

1.辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁沈阳 110847；2.辽宁中医药大学基础医学院，辽宁沈阳 110847

[摘要]目的研究脾气虚大鼠焦虑程度的变化并探讨其可能机制。方法选取雄性SD大鼠16只，体质量（200±10）g，将其随机分为对照组和脾气虚组（模型组），每组8只。旷场实验评价大鼠焦虑程度；ELISA法测定海马组织ATP和缩胆囊素-8（CCK-8）含量；免疫组化法检测海马CCKB型受体（CCKBR）表达。结果与对照组比较，模型组的焦虑程度显著降低（P＜0.01），海马组织的 ATP 含量降低（P＜0.05），海马 CCK-8 水平变化不明显（P＞0.05），但其受体表达下降（P＜0.05）。结论脾气虚时焦虑程度下降，其初步机制与海马能量不足和CCKBR表达减少有关。

[关键词]脾气虚；焦虑；缩胆囊素-8；缩胆囊素B受体；ATP

焦虑是机体在适应新环境过程中所表现出的一种基本情绪，具有一定的趋避性，适度焦虑具有保护意义。研究发现，海马缩胆囊素（cholecystokinin，CCK）及其 B 型受体（CCK B receptor，CCKBR）与焦虑的形成关系密切[1-4]。中医将焦虑归属神志范畴，由心所主，但也依赖于脾主运化的功能，因为神志受气血供养，而脾为气血生化之源，如果脾气不足，则神失所养，焦虑程度势必受到影响，但目前没有相关报道。本研究首先观察脾气虚状态下大鼠的焦虑样行为变化，进而围绕海马CCK及其受体表达探讨其发生机制。

1.1 实验动物与分组

选取SPF级雄性SD大鼠16只，体质量（200±10）g，购于本溪实验动物中心[许可证号：SCXK（辽）-2010-0001]，随机分为对照组和脾气虚组（模型组），每组8只。大鼠饲养于辽宁中医药大学实验动物中心[许可证号：SYXK（辽）-2013-000-9]，自由饮水进食，18～23℃，相对湿度45%～55%。适应性饲养1周后开始实验。

1.2 脾气虚模型的复制方法及评价标准

模型组大鼠按文献[5-6]方法复制和评价脾气虚证模型，即15d内给予饥饱失常刺激（饱食1 d+禁食2d，共5个循环），同时每日水温35～37℃游泳至力竭，以大鼠出现消瘦、食少、神疲和乏力等表现为模型复制成功。

1.3 大鼠焦虑程度评价

采用旷场实验（open-field test，OFT）法评价。 将大鼠放入OFT-100大小鼠开场活动实验系统的箱体中心，记录其5 min内在不同区域的活动时间。将箱体底部分为25个小格，规定中间9格为中心区域，四角的四格为角落区域，其他12个格为周边区域。焦虑程度＝（角落活动时间＋周边活动时间）/中心活动时间[7-9]。彻底清洁箱体后，检测下1只大鼠。

1.4 海马组织ATP和CCK-8含量检测

采用ELISA法。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（3.5 ml/kg）后，取双侧海马组织，按文献[10]方法，应用Bio-Rad美国伯乐iMark酶标仪，严格按试剂盒说明书操作。

1.5 海马CCKBR表达

采用免疫组化法。按文献[11]方法，即制备海马石蜡切片（4 μm）后，常规脱水，双氧水封闭，PBS 洗 3 min×3 次，柠檬酸缓冲液（0.01 mol/L，pH6.0），微波炉高火3 min，低火维持15 min，冷却至室温后PBS洗3 min×3次；滴加血清封闭液，37℃水浴30 min，弃血清，滴加兔抗大鼠CCKRB受体多克隆抗体（1∶300，三蒸水稀释），4.0℃过夜；37℃水浴 2 h；PBS 洗 3 min×3 次，滴加羊抗兔 IgG，37℃水浴 30 min；PBS洗 3 min×3次，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇二甲苯脱水，中性树胶封片。阴性对照采用抗体稀释液代替一抗，步骤同上。镜下CCKBR阳性反应物呈棕黄色，采用BI-2000医学图像分析系统分析其平均光密度。

1.6 统计学处理

采用统计学软件SPSS 17.0分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用 t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组大鼠焦虑程度的比较

由图1和表1可见，对照组大鼠主要活动于角落和周边区域，较少通过中心区域；与此相比，模型组大鼠在中心区域活动增加，活动时间显著延长，角落活动时间明显增加，周边活动时间无明显变化，但焦虑程度低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

 

图1 大鼠典型运动轨迹（0→MAX表示活动时间增加）

A.对照组；B.模型组

表1 两组大鼠焦虑程度的比较（±s，n=8）

 

与对照组比较，*P＜0.01

2.2 两组大鼠海马组织ATP和CCK水平及CCKBR表达的比较

与对照组比较，模型组海马ATP含量和CCKBR表达低于对照组（均P＜0.05），但CCK-8水平虽然减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 海马组织ATP和CCK-8水平及CCKBR表达的比较（±s，n=8）

 

与对照组比较，*P＜0.05

随着焦虑症发病率日渐提高，相应的中医研究和治疗也成为社会需求[12-14]。但中医典籍中无焦虑症的明确记载，特别是目前尚不清楚五脏与焦虑的关系，因此开展相关研究具有一定的现实意义。

与焦虑症不同，焦虑属于一种具有适应性意义的重要情感反应，能够提高大脑的反应性和警觉性，协调机体各部分功能，以应对威胁自身安全的危险情景。焦虑虽属于负性情绪，但其趋避特性可以让机体远离危险，因此具有重要的保护意义。检测动物焦虑样行为的方法较多，本研究选用了OFT。OFT可以检测啮齿类动物自发活动和探索行为，最初应用于大鼠，后来逐步推广到小鼠及其他动物，现在也多用于检测大鼠的焦虑样行为[15-17]。本研究观察到，对照组大鼠进入旷场后，因对中心空旷区域存在畏惧，而更多地选择活动于角落和周边区域，即使通过中心区域也只是短暂停留，不会表现出较长时间的探究行为，产生较为明显的趋避性，焦虑程度较高，显示该组大鼠具有较为强烈的自我保护意识。

中医将自然界中各种事物的运动变化称为“神”，即“阴阳不测谓之神”（《素问·天元纪大论》），并认为心总管机体对外来刺激的应答，即心主神志。心具有“任物”功能，即接受和处理外来信息，对外界变化作出相应判断，以形成精神、意识和思维等活动。不过，心还需要其他四脏支持，才能正常执行“任物”功能，特别是脾化生气血的功能。中医认为气血为神的物质基础，如“血气者，人之神”（《素问·八正神明论》，“血者，神气也”（《灵枢·营卫生会》），因此，只有脾运正常，气血化生充足，从而维持心主神志功能，以正常“任物”，而脾气不足则导致气血化生不足，削弱心的“任物”能力，使其难以正确应对外来刺激，引起机体功能紊乱，甚至危及生命，即“得神者昌，失神者亡”（《素问·移精变气论》）。

鉴于脾主运化功能是神志活动的基础，本研究通过观察脾气虚大鼠的焦虑样行为变化，探讨脾与焦虑的关系。实验结果显示，模型组大鼠进入旷场后，其在中心区域活动时间明显延长，而角落停留时间变短，焦虑程度显著低于对照组。该组大鼠的上述表现提示，脾气虚时机体处在新的环境中，对未知危险的感知能力下降，不能正确应对潜在危险，自身保护能力不足。

海马是行为和情绪形成的重要结构，其神经元功能状态直接影响机体对外界的应答。本研究结果显示，模型组大鼠海马ATP含量显著低于对照组，提示海马神经元能量供给不足与脾气虚时焦虑程度下降有关。许多研究认为，ATP是气血的物质基础之一[18-19]，由此推测脾可以通过生成ATP的方式维持机体适度焦虑。此外，海马神经元的相关神经递质在焦虑样行为产生中发挥重要作用。CCK-8虽然首先发现于胃肠道，却是广泛分布于大脑的一种重要神经肽，尤其以海马结构表达最为丰富。研究发现，CCK-8结合其受体后可以在认知行为、摄食和学习记忆等方面扮演重要角色，而其在焦虑方面的作用尤受重视[1-4]。本研究结果显示，模型组海马组织CCK-8水平虽无明显下降，但其受体表达显著低于对照组，提示该受体介导的海马神经元生物学效应可能出现异常，其中可能涉及了行为和情绪的产生等，但详细作用还需要后续工作证实。

综上所述，脾气虚可降低焦虑程度，其初步机制与海马能量不足和CCKBR表达减少有关。

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Study of anxiety-like behaviour and the initial mechanism of rats in spleen qi deficiency

LIU Wen-jun1CHAI Ji-yan1XIE Xin1WU Cheng-ju1CHEN Jing1SHAN De-hong2▲
1.The Teaching Laboratory Center,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China;2.Faculty of Basic Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China

[Abstract]ObjectiveTo study the anxiety degree change of rats in spleen qi deficiency rat and discuss its initial mechanism.Methods16 male SD rats with the body mass of(200±10)g were selected and they were randomly divided into the control group and spleen qi deficiency group(model group),and there were 8 rats in each group.Open-field test(OFT)was used to evaluate anxiety degree of rats.ELISA was chosen to measure ATP and CCK-8 concentrations in hippocampal tissue.Immunohistrochemical method was used to check CCKBR expression in hippocampal tissue.ResultsCompared with those in the control group,rat′s anxiety was reduced(P＜0.01),hippocampal ATP level was decreased(P＜0.05),hippocampal CCK-8 concentration was unchanged(P＞0.05),hippocampal CCKBR expression was decreased(P＜0.05)in the model group.ConclusionAnxiety in spleen qi deficiency is lower and its initial mechanism might involve in decrease of hippocampal ATP level and CCKR expression.

[Key words]Spleen qi deficiency;Anxiety;Cholecystokinin-8;CCKB receptor;ATP

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）07（b）-0004-03

（收稿日期：2017-06-05 本文编辑：许俊琴）

[基金项目]国家重点基础研究发展计划（2013CB531702）

[作者简介]刘文俊（1990-），男，硕士，助理实验师，主要从事脾胃生理机制研究

▲通讯作者：单德红，男，教授，硕士研究生导师