徐 佳1刘 滢2于 淼2冯永辉2吕昌龙2

1.沈阳医学院病原生物学教研室，辽宁沈阳 110034；2.中国医科大学免疫学教研室，辽宁沈阳 110122

[摘要]目的分析口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道局部的表达情况。方法用脂质体包裹pCDNA3.1+/Ag85A DNA质粒制成口服疫苗。对照组雌性C57BL/6小鼠5只用生理盐水灌胃，实验组雌性C57BL/6小鼠5只用脂质体包裹的Ag85A DNA疫苗灌胃。共免疫3次，每次间隔14 d。免疫结束后14 d处死小鼠，取小肠组织固定于4%多聚甲醛中备用。采用免疫荧光和免疫组化方法检测两组小鼠小肠派氏淋巴结、派氏淋巴结内的树突状细胞和小肠黏膜上皮细胞中Ag85A的表达情况。结果在实验组小鼠的小肠黏膜上皮细胞、派氏淋巴结以及派氏淋巴结内的树突状细胞中均检测到重组pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗的表达，而且不同部位的小肠黏膜上皮细胞中Ag85A的表达强度不同，靠近固有层的小肠黏膜上皮细胞内Ag85A的表达强度比靠近肠腔侧的小肠黏膜上皮细胞高（P＜0.05）。在对照组小鼠上述部位无重组DNA疫苗的表达。结论脂质体包裹的口服DNA疫苗能够被小鼠肠道吸收，同时可诱导特异性黏膜免疫反应。

[关键词]Ag85A；DNA疫苗；脂质体；上皮细胞；树突状细胞；小鼠

Ag85A是结核分枝杆菌的一种外分泌蛋白，能够刺激机体产生特异性免疫应答，包括体液免疫应答和细胞免疫应答。卡介苗（BCG）也包含编码Ag85A的基因。研究表明，裸DNA疫苗经肌内注射后，其目的基因表达在肌细胞内而且能够诱导机体产生免疫应答[1-2]，该裸DNA疫苗经肌内注射后主要引起Th1免疫应答，而经基因枪注射后主要引起Th2免疫应答，同时相应的抗体产生水平升高[3-4]。然而，目前还没有口服DNA疫苗在消化道局部表达的报道。本实验通过检测口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗的基因表达产物在C57BL/6小鼠肠道局部的表达，为临床经口服用DNA疫苗提供理论依据。

1.1 材料

脂质体包裹的口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗为中国医科大学免疫学教研室制备，其中的LipofectamineTM2000购于Invitrogen公司；6～8周龄的雌性C57BL/6小鼠由中科院上海实验动物中心提供，合格证号：中科动管第005号；无内毒素超纯质粒DNA提取、纯化试剂盒购于Promega公司；Jackson ImmunoResearch Laboratories提供Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG；Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c购于BD Pharmingen公司；FITC-goat-anti-chicken IgY和 HRP-goat-antichicken IgY二抗购于Gene公司；chicken anti-Ag85A IgY一抗购于Prosci公司；DAB显色试剂盒和牛血清蛋白（BSA）购自北京中杉公司。

1.2 疫苗制备

将Ag85A基因序列全长扩增，经测序、同源性分析后，插入pCDNA3.1+真核表达载体，经鉴定正确后转化入DH5α扩增，无内毒试剂盒提取、纯化质粒pCDNA3.1+/Ag85A，灌胃前将脂质体LipofectamineTM2000与质粒充分混匀，4℃静置20 min，待脂质体充分包裹后制成口服DNA疫苗[5]。

1.3 动物分组及免疫

将10只雌性6～8周龄的C57BL/6小鼠随机分成两组，免疫前2 h禁食水。用7.5%NaHCO3和Hank液按1∶4比例混合制备胃酸中和液，每只鼠灌胃300 μl胃酸中和液中和胃酸，30 min后灌胃免疫。实验组小鼠灌胃 100 μg脂质体包裹的重组 pCDNA3.1+/Ag85A质粒DNA疫苗，对照组小鼠灌胃等量的生理盐水。每组小鼠免疫3次，每次间隔14 d[6]。

1.4 免疫组化技术检测小鼠肠道局部Ag85A的表达

在口服疫苗免疫结束后14 d处死小鼠，PBS冲洗小肠组织，将含有派氏淋巴结的小肠组织置入4%多聚甲醛备用。标本经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，进行石蜡包埋、切片。标本经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，加3%H2O2封闭10 min。抗原修复后用5%BSA封闭。chicken anti-Ag85A IgY（1∶400） 4℃过夜后再用HRP-goat-anti-chicken IgY（1∶200）37℃孵育 30 min。DAB显色、苏木精染色、0.5%～1%盐酸乙醇分化后，再经梯度乙醇脱水和二甲苯透明。抗体孵育、染色等操作后均用PBS洗3次，5 min/次。中性树胶封片后用普通光学显微镜观察Ag85A在小鼠肠黏膜上皮细胞、派氏淋巴结和派氏淋巴结内树突状细胞中的表达。

1.5 免疫荧光技术检测小鼠肠道局部Ag85A的表达

将4%多聚甲醛固定24 h后的小鼠小肠组织置于30%蔗糖溶液中4℃过夜，待组织标本沉至蔗糖溶液底部后取出，OTC包埋，冰冻切片，厚度约5 μm。晾干后的标本分别用3%H2O2和5%BSA 37℃封闭30 min 后，同时加 chicken anti-Ag85A IgY 一抗（1∶400）和 Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c（1∶20）一抗 4℃过夜，FITC-goat-anti-chicken IgY 二抗（1∶200）和Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG（1∶75）同时 37℃避光孵育 30 min，甘油封片后置于荧光显微镜下观察Ag85A在小鼠肠黏膜上皮细胞、派氏淋巴结和派氏淋巴结内树突状细胞中的表达情况。

1.6 统计学分析

用SPSS 18.0统计学软件对计量资料进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组小鼠小肠黏膜上皮细胞及派氏淋巴结中Ag85A表达的比较

免疫组化和免疫荧光结果显示，实验组小鼠小肠黏膜上皮细胞和派氏淋巴结中均有Ag85A广泛表达，而对照组小鼠上述部位无Ag85A表达。在实验组小鼠不同部位的小肠黏膜上皮细胞中，Ag85A的表达强度不同。在相同平均光密度和平均灰度值的条件下，靠近固有层的小肠黏膜上皮细胞内Ag85A的平均积分光密度为17.4416±5.5412，总平均灰度值为15 167.1800±326.8648，而靠近肠腔侧的小肠黏膜上皮细胞内Ag85A的平均积分光密度为7.4114±1.8510（t=3.750，P=0.020），总平均灰度值为 7165.3120±158.6779（t=53.369，P=0.000），表明靠近固有层的小肠黏膜上皮细胞中Ag85A的表达强度比靠近肠腔侧的小肠黏膜上皮细胞高，差异有统计学意义（图1、2）。

 

a.对照组小鼠小肠派氏淋巴结；b.实验组小鼠小肠派氏淋巴结；c.对照组小鼠小肠上皮；d.实验组小鼠靠近固有层侧小肠上皮；e.实验组小鼠靠近肠腔侧小肠上皮（×400）

 

图2 免疫荧光技术检测小鼠小肠黏膜上皮细胞和小肠内派氏淋巴结中Ag85A的表达

f.对照组小鼠小肠派氏淋巴结；g.实验组小鼠小肠派氏淋巴结；h.对照组小鼠靠近固有层侧小肠上皮；i.实验组小鼠靠近固有层侧小肠上皮；j.对照组小鼠靠近肠腔侧小肠上皮；k.实验组小鼠靠近肠腔侧小肠上皮（×400）

2.2 Ag85A在两组小鼠小肠派氏淋巴结内树突状细胞中表达的比较

免疫荧光结果显示，Ag85A在实验组小鼠小肠派氏淋巴结内的树突状细胞中也有表达，但表达的细胞数量较少，而在对照组小鼠上述部位无表达（图3）。

 

图3 免疫荧光技术检测小鼠小肠派氏淋巴结内树突状细胞中Ag85A的表达

研究表明，DNA疫苗可以用于治疗感染、肿瘤和超敏反应以及器官移植[7]，而口服疫苗是一种被广泛接受的给药方法，具有许多优点[8]。肠道是接触抗原物质最多的器官，因此被认为是人体最大的免疫器官。肠道相关淋巴组织，包括肠系膜淋巴结和派氏淋巴结，通常被认为是发生免疫反应的主要场所，而发挥免疫效应的细胞则遍布于肠黏膜内[9-10]。尽管正常个体可能会在肠道甚至在血清中对这些无害性抗原产生低水平的抗体反应[11]，但是在生理环境中活跃的T细胞反应通常不会发生。在某些病理条件下，上述免疫反应可导致肠绞痛和克罗恩病等肠道疾病的发生[12-13]。肠道对无害性抗原的免疫低反应状态被称为口服耐受。口服耐受在维护机体正常生理功能中发挥重要作用，但也对口服疫苗的有效性提供了一个艰巨的挑战。

M细胞被认为是肠道内最有效的将抗原从肠腔转运到肠道相关淋巴组织的细胞[14]，是黏膜疫苗作用的关键，也是很多病毒和细菌侵入机体致病的关键[15-16]。研究表明，M细胞可以摄取经脂质体包裹的DNA疫苗，从而启动肠道黏膜免疫应答[5]。还有报道称小肠黏膜内的树突状细胞也可以摄取抗原物质[17-18]。本研究在实验组小鼠小肠派氏淋巴结内部分树突状细胞中观察到了Ag85A DNA疫苗的表达，而在小肠黏膜内树突状细胞中未见疫苗编码蛋白的表达。本实验还发现，实验组小鼠小肠黏膜上皮细胞和小肠内派氏淋巴结中均有Ag85A的表达。不同部位的小肠黏膜上皮细胞中Ag85A的表达强度不同，靠近固有层的小肠黏膜上皮细胞比靠近肠腔侧的小肠黏膜上皮细胞高，其机制还有待进一步研究。

[1]Neeraj Dhar，Vivek Rao，Anil K，et al.Immunogenicity of recombinant BCG vaccine strains overexpressing components of the antigen 85 complex of Mycobacterium tuberculosis[J].Med Microbiol Immunol（Berl），2004，193（1）：19-25.

[2]Suttmann H，Jacobsen M，Reiss K，et al.Mechanisms of bacillus Calmette-Guerin mediated natural killer cell activation[J].J Urol，2004，172（4 Pt 1）：1490-1495.

[3]BaldwinSL，SouzaDD，OrmeIM，etal.Immunogenicityand protective efficacy of DNA vaccines encoding secrected and nonsecrected forms of Mycobacterium tuberculosis Ag85A[J].Tuber Lung Dis，1997，79（4）：251-259.

[4]Huygen K，Content J，Denis O，et al.Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine[J].Nat Med，1996，2（8）：893-898.

[5]徐佳.口服Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道M细胞的表达[J].沈阳医学院学报，2010，12（4）：197-207.

[6]徐佳，刘滢，王大南，等.口服A985A DNA疫苗表达产物在脾脏的分布[J].国际免疫学杂志，2009，32（2）：85-88.

[7]Zaman M，Ozberk V，Langshaw EL，et al.Novel platform technology for modularmucosalvaccine that protects against streptococcus[J].Sci Rep，2016，6：39274.

[8]Bemark M，Hazanov H，Stromberg A，et al.Limited clonal relatedness between gut IgA plasma cells and memory B cells afteroralimmunization[J].Nat Commun，2016，7：12698.

[9]Mowat AMcI，Viney JL.The anatomical basis of mucosal immune responses[J].Immunol Rev，1997，156：145-166.

[10]Mowat AM.Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens[J].Nat Rev Immunol，2003，3（4）：331-341.

[11]MacPherson AJ，Uhr J.Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria[J].Science，2004，303（5664）：1662-1665.

[12]Paiatto LN，Silva FG，Bier J，et al.OralToleranceInduced by OVA Intake Ameliorates TNBS-Induced Colitis in Mice[J].PLoS One，2017，12（1）：e0170205.

[13]Mowat AM，Weiner HL.Basic mechanisms and clinical implications of oral tolerance[J].Opin Gastroenterol，1999，15（6）：546-556.

[14]Wang D，Xu J，Feng Y，et al.Liposomal oral DNA vaccine（mycobacterium DNA） elicits immune response[J].Vaccine，2010，28（18）：3134-3142.

[15]Pickard JM，Chervonsky AV.Sampling of the intestinal microbiota by epithelial m cells[J].Curr Gastroenterol Rep，2010，12（5）：331-339．

[16]Lim JS，Na HS，Lee HC，et al.Caveolae-mediated entry of Salmonellatyphimurium in a human M-cell model[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，390（4）：1322-1327.

[17]Leu SJ，Yang YY，Liu HC，et al.Valproic acid and lithium meditate anti-inflammatory effects by differentially modulating dendritic cell differentiation and function[J].J Cell Physiol，2016.DOI：10.1002/jcp.25604.

[18]Falcón CR，Masih D，Gatti G，et al.Fasciola hepatica Kunitz type molecule decreases dendritic cell activation and their ability to induce inflammatory responses[J].PLoS One，2014，9（12）：e114505.

Expression of Oral pCDNA3.1+/Ag85A DNA vaccine in the intestine of mice

XU Jia1LIU Ying2YU Miao2FENG Yong-hui2LYU Chang-long2
1.Department of Pathogenic Biology,Shenyang Medical College in Liaoning Province,Shenyang 110034,China;2.Department of Immunology,China Medical University in Liaoning Province,Shenyang 110122,China

[Abstract]ObjectiveTo analyze the expression of oral pCDNA3.1+/Ag85A DNA vaccine in the intestinal tract of mice.MethodsOral vaccine was made using liposomes to parcel pCDNA3.1+/Ag85A DNA plasmid.5 female C57BL/6 mice in control group were given saline water for gavage while 5 female C57BL/6 mice in experimental group were given liposome encapsulated Ag85A DNA vaccine for gavage.The mice were immunized three times with 14 days interval between each time.In the fourteenth day after immunization,cervical dislocation executed in mice and the small intestine was fixed with 4%paraformaldehyde to be prepared to detect the expression of Ag85A in the intestinal Peyer patches,the dendritic cells in Peyer patches and intestinal epithelial cells with immunofluorescence and immunohistochemistry methods.ResultsOral vaccine pCDNA3.1+/Ag85A DNA was expressed in intestinal Peyer patches,the dendritic cells in Peyer patches and the intestinal epithelial cells of mice in the experimental group,and in different parts of the intestinal epithelial cells in mice of the experimental group,the expression intensity of Ag85A was different.The expression intensity of Ag85A was higher near the lamina propria than near the lumen of intestinal epithelial cells(P＜0.05).It was not expressed in above parts of mice in the control group.ConclusionOral DNA vaccine parceled with liposomes can be absorbed by intestinal tract of mice and induce specific mucosal immune response.

[Key words]Ag85A;DNA vaccine;Liposomes;Epithelial cells;Dendritic cells;Mice

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）06（c）-0004-04

（收稿日期：2017-01-23 本文编辑：许俊琴）

[基金项目]沈阳医学院科技基金项目（20132029）

[作者简介]徐佳（1980-），女，硕士，讲师，研究方向：环境与健康，微生物、微生态