李 墨 赵辉

沈阳市红十字会医院药剂科，辽宁沈阳 110013

[摘要]目的建立芍药甘草汤中甘草酸铵的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，Phenomenex ODS柱（5 μm，250.0 mm×4.6 mm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸溶液，时间梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；检测波长为237 nm；柱温为30℃。结果甘草酸铵进样量在6.992～174.800 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.9991），平均回收率为98.62%（n=6），RSD为0.28%。结论 本方法操作简便，结果准确、可靠，可用于芍药甘草汤的质量控制。

[关键词]芍药甘草汤；甘草酸铵；高效液相色谱；质量控制

中药方剂芍药甘草汤出自东汉医圣张仲景的《伤寒论·辨太阳病脉证并治上》，该处方由芍药、炙甘草两味中药材组成，主治阴液亏虚、肝失疏泄，脾失健运，实验显示其具有抗炎、镇静、镇痛等药理作用，在临床上被广泛应用于消化、神经、呼吸系统还有妇科类病症的预防与治疗[1-6]。现代药理实验显示，芍药甘草汤主要有松弛骨骼肌、解痉镇痛、抗溃疡等作用，因此临床使用非常广泛[7-11]。两味中药在药效方面有协同作用，甘草酸铵是方剂芍药甘草汤中解痉镇痛的主要药效物质基础[12-17]，经甘草配伍使用后疗效生增强，体现了配伍“七情”中的相使。本研究采用高效液相色谱法测定对芍药甘草汤中有效成分甘草酸铵进行含量测定，该方法可靠、简单、灵敏，可用于芍药甘草汤的质量控制和标准研究。

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（DAD检测器，四元梯度泵）；Bandelin Sonorex RK 1208BH超声波清洗器；Memmert8孔电热水浴锅；METTLER Toledo AB265-S电子天平（瑞士）。

1.2 试剂与药品

甘草酸铵（批号：110731-201116，购于中国食品药品检定研究院）。液相用甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，液相用水为Millipore超纯水，其余试剂均为分析纯。白芍、炙甘草均购于沈阳东北大药房，经沈阳市红十字会医院药剂科副主任药师赵辉鉴定为真品，分别为毛茛科芍药属植物白芍（Paeonia lactiflora Pall.）、豆科甘草属植物炙甘草（Radix Glycyrrhizae Preparata）。

2.1 芍药甘草汤的制备

按芍药甘草汤方剂构成取芍药，甘草（炙）各10 g合并，每次加水8倍量、8倍量和6倍量煎煮3次，第1次的煎煮时间为1 h，后两次的煎煮时间为1.2 h，合并煎液并过滤，减压浓缩致干备用。

2.2 色谱条件

Phenomenex ODS柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱见表1；检测波长：237 nm。理论板数按甘草酸铵峰计算应≥5000。

表1 高效液相色谱流动相洗脱梯度

2.3 对照品溶液的制备

甘草酸铵对照品适量，精密称定1.748 mg，精密加入10 ml 70%乙醇溶液，制成每1 ml含甘草酸铵174.8 μg的储备液。

2.4 供试品溶液的制备

取芍药甘草汤提取物1.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入70%甲醇100 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品及样品色谱图见图1、图2。

 

图1 对照品色谱图

 

图2 供试品色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 方法专属性 按选取的色谱条件，供试品溶液中的杂质对甘草酸铵的测定无干扰。

2.5.2 线性关系 精密吸取对照品溶液10 μl进样，以甘草酸铵的峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X）为横坐标，采用多元回归运算，得甘草酸铵的回归方程分别为Y=2149X+1.725（r=0.9991）。结果显示，甘草酸铵在6.992～174.8 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5.3 精密度试验 取供试品溶液6份，按照选取的色谱条件测定，进样10 μl，考察日内及日间精密度。结果显示，甘草酸铵日内精密度（n=6）为0.96%；日间精密度（n=6）为1.24%。

2.5.4 回收率试验 称取已知含量的芍药甘草汤，精密加入一定量的甘草酸铵对照品，按供试品溶液的制备操作，制备中、低、高3种浓度（甘草酸铵）的样品，每次平行操作（n=6），进样10 μl，分别记录其峰面积并代入标准曲线，计算出三种浓度对照品的质量浓度，以测定量与加入量的比值计算方法回收率及高、中、低3种浓度的回收率与RSD，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.5.5 样品稳定性试验 精密吸取供试品溶液，按选取的色谱条件测定，分别在0、1、2、4、8、12 h进样10 μl，记录峰面积，甘草酸铵RSD分别为0.56%、1.02%、1.16%、1.08%、1.20%、1.15%，结果显示，芍药甘草汤样品溶液在12 h内稳定。

2.6 芍药甘草汤提取物含量测定

按芍药甘草汤提取物的制备方法制备3批芍药甘草汤提取物，按本实验所选取的色谱条件对3批芍药甘草汤提取物进行测定，结果显示，甘草酸铵含量为（141.60±3.511）μg/ml，RSD为2.45%。

本研究中，预试验比较了乙腈-冰乙酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液的梯度洗脱系统，结果显示乙腈-0.05%磷酸水溶液洗脱系统中出现的色谱峰较多且分离效果较好，能够满足液相图谱对色谱峰的要求。采用DAD检测器在210～400 nm范围内波长采集光谱图，在237 nm处有最大吸收，确定为最终检测波长。流动相曾采用30%乙腈作溶剂，比较振摇与超声预处理等试验，对最后测定值影响比较小。本方法非常简便，测定结果准确可靠，可用于芍药甘草汤的质量控制。

芍药甘草汤是出自《伤寒论》的经典名方，由芍药、甘草2味中药组成，其中芍药酸寒、养血敛阴，甘草甘温、健脾益气。目前对芍药甘草汤物质基础的研究主要集中在对白芍、甘草的化学成分的孤立分析，并未对各化学成分之间的相互制约、相互协同作用作出整体评价，认为中药及其复方的临床疗效就是各化学成分的作用的简单加和，并以此来解释芍药甘草汤的临床疗效，这有悖于中医药整体观理论，因此，随着中药研究的不断深入以及中药药效组分理论的不断发展，对芍药甘草汤的药效物质基础研究也将更加明确，这对传承中药文化有积极意义。

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Content of ammonium glycyrrhetate in Shaoyao Gancao Decoction by HPLC

LI Mo ZHAO Hui
Department of Pharmacy,Red Cross Hospital of Shenyang City,Liaoning Province,Shenyang 110013,China

[Key words]Shaoyao Gancao Decoction;Ammonium glycyrrhetate;High performance liquid chromatography;Quality control

[中图分类号]R927.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）05（c）-0101-03

（收稿日期：2017-03-05 本文编辑：祁海文）

[作者简介]李墨（1983-），女，硕士，主管中药师，研究方向：中药复方质量标准

[Abstrac]ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of ammonium glycyrrhetate in Shaoyao Gancao Decoction.MethodsHPLC was performed on the Phenomenex ODS(250.0 mm×4.6 mm,5 μm)with acetonitrile-0.05%phosphoric acid with a gradient elution program as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min,237 nm as the detection wavelength,the temperature of column was at 30℃.ResultsThe linear range of ammonium glycyrrhetate was 6.992-174.800 μg(r=0.9998)and the average recovery rate was 98.62%(n=6)with RSD 0.28%.ConclusionThe results showed that this method was simple,accurate,reliable,and could be used for quality control of Shaoyao Gancao Decoction.