朱汝森1陈兴贵2兰柳波3李锦宏1杨 帆1

1.广东医科大学附属医院神经外科，广东湛江 524001；2.广东医科大学附属医院肿瘤中心，广东湛江 524001；3.广东医科大学生物化学与分子生物学研究所，广东湛江 524023

[摘要]目的检测人骨髓间充质干细胞（hMSCs）对脑胶质瘤细胞生长增殖的影响，评估应用hMSCs治疗人脑胶质瘤的生物安全性。方法获取hMSC的条件培养基 （hMSCs-CM）；实验组人脑胶质瘤细胞U251培养于hMSCs-CM，对照组U251细胞培养于hMSCs-CM的基础培养基；以MTT实验检测细胞增殖能力的变化。结果MTT结果显示，与对照组比较培养于hMSCs-CM的实验组U251细胞的增殖能力明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论hMSCs-CM可促进脑胶质瘤细胞的增殖，对hMSCs应用于脑胶质瘤治疗的生物安全性问题需引起关注。

[关键词]骨髓间充质干细胞；脑胶质瘤；基因治疗；细胞增殖

骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，MSCs）由于具有在中枢神经系统中独特的迁移性及对脑胶质瘤细胞的定向迁移能力，在很多研究中发现可以有效地将治疗基因转送到脑胶质瘤中，以MSCs作为基因载体对脑胶质瘤进行靶向基因治疗的研究近年来成为热点[1-5]。目前更多的研究所关注的是MSCs作为基因载体这种应用的有效性，而关于MSCs自身对脑胶质瘤细胞的作用未被重视。对于是否存在MSCs自身可促进脑胶质瘤细胞生长增殖的风险并未明确，而这关系到应用MSCs治疗脑胶质瘤的生物安全性问题。本实验通过检测人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，hMSCs）对人脑胶质瘤细胞生长增殖的影响，评估应用hMSCs治疗人脑胶质瘤的生物安全性。

1.1 人骨髓间充质干细胞的获取和培养

在前期的研究中已经建立了获取hMSCs的成熟方法[6]。抽取健康成人志愿者的骨髓组织，于Percoll细胞分离液（瑞典Pharmacia）中通过密度梯度离心获取中间的有核细胞层，接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基（美国Hyclone），置于37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后换液，去除未贴壁的细胞，每周更换培养液两次，待细胞密度达70%～ 80%后，以0.25%胰酶＋0.02%EDTA消化传代。取第2～10代的细胞作后续实验。

1.2 人骨髓间充质干细胞诱导分化能力的检测

将第2～5代的hMSCs以0.25%胰酶＋0.02%EDTA消化，按1×105个/cm2的密度培养于含有B27/N2（美国Gibco BRL）的无血清DMEM/F12培养液，并加入20 ng/ml的EGF和bFGF（美国Sigma），置于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养液每周更换一次，生长因子每周添加2次。培养10～15 d后，神经球样结构可见形成。将神经球样结构的细胞以4%的甲醛固定，通过常规免疫组化的方法检测神经干细胞标志性蛋白nestin的表达。免疫组化实验所使用的抗体及浓度为：兔抗人nestin，1∶500（美国Chemicon International）和山羊抗兔IgG Cy3，1∶100（美国Chemicon International）。细胞核以DAPI染色。

1.3 人骨髓间充质干细胞的条件培养基 （hMSCs-CM）的制备

将hMSCs以0.25%胰酶＋0.02%EDTA消化，接种于75 cm2的培养皿，加入DMEM-F12加10%胎牛血清，培养于含5%CO2的37℃细胞培养箱，待细胞密度达70%～80%，以无血清的DMEM/F12洗涤，然后加入9 ml的DMEM/F12含0.1%BSA，培养3 d后，吸取培养液，通过离心（1000 g，5 min），并以孔径为0.22 μm的滤膜过滤，以去除细胞，获得hMSCs-CM。将基础培养基（DMEM/F12含0.1%BSA）作为实验的对照培养基（control medium）。

1.4 MTT实验检测hMSCs-CM对人脑胶质瘤细胞U251增殖的影响

将对数期U251细胞以1×103个/孔接种于96孔板，正常培养24 h后，吸除原培养基，以无血清的DMEM/ F12洗涤后，实验组加入200 μl hMSCs-CM，对照组加入200 μl对照培养基（control medium），每组设12个复孔。培养24 h后予换液，继续培养至48 h后，于每孔加入5 μg/ml MTT溶液20 μl，以37℃孵育4 h后，将上清液全部弃去，每孔加入二甲亚砜 （DMSO）溶液200 μl，溶解紫色结晶沉淀，振荡10 min，用酶标仪在570 nm处测定其光密度（OD值）。实验重复3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 hMSCs的获取和鉴定

获得的hMSCs通过传代培养后的呈长梭形，贴壁牢固，通过诱导分化培养，hMSCs可形成类似神经干细胞构成的神经球样结构，组成神经球样结构的细胞高度表达神经干细胞标志性蛋白nestin（图1）。

 

图1 人骨髓间充质干细胞的诱导分化（×100）

2.2 hMSCs-CM对人脑胶质瘤细胞U251生长增殖的影响

获得hMSCs条件培养基（hMSCs-CM），将hMSCs-CM的基础培养基作为对照培养基。光镜下观察发现，培养于hMSCs-CM的人脑胶质瘤细胞U251与对照组比较，生长更加旺盛（图2A）。MTT实验结果显示，培养于hMSCs-CM的实验组U251细胞增殖能力较对照组明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）（图2B）。

脑胶质瘤是人类一种重要的肿瘤相关的致死因素，尽管通过广泛的外科切除及放疗、化疗等其他的治疗手段，其预后一直以来都是很差；现行的标准治疗手段对脑胶质瘤治疗所存在的困难是与其瘤细胞向周围正常组织浸润性生长的特性密切相关[7-8]。正是胶质瘤细胞这种呈浸润性生长的特性也使得一些基因治疗策略以及局部介入的治疗方法亦难以很好地到达浸润到周围正常组织的胶质肿瘤细胞[9-11]。MSCs基于其具有的在中枢神经系统中独特的迁移特性以及其对胶质瘤细胞良好的趋向性，可以有效地将目的治疗基因输送到胶质瘤细胞，因此也为脑胶质瘤的基因治疗带来了新的希望。

然而，在临床应用前，对于hMSCs在为基因载体对脑胶质瘤进行基因治疗的生物安全性问题必须得到彻底的认识和明确。有研究报道，当MSCs和某些肿瘤细胞共同种植时可表现出促进肿瘤生长的作用，其中包括乳腺癌[12-13]、卵巢癌[14]、黑色素瘤[15]及结肠癌[16]等。有研究指出，MSCs可整合到肿瘤间质，并通过旁分泌一些细胞因子，包括CCL5、IL-6、及SDF-1α等促进肿瘤的生长[12-14]；MSCs可作为肿瘤前体的成纤维细胞通过分化和分泌促癌因子在肿瘤的发生发展中其重要作用[16]；MSCs亦可通过其免疫抑制的特性帮助肿瘤细胞逃避宿主的免疫监控而促进肿瘤的发生和发展[15]。然而，也有研究得到了一些相反的结果，发现MSCs与肿瘤细胞共同种植可以抑制肿瘤的生长，包括结肠癌[17]、肝细胞癌[18]、黑色素瘤[19]等。 似乎对于MSCs移植后对肿瘤生长的作用是因肿瘤而异的，与一系列的因素有关，包括MSCs的获取和培养的方法、实验的模型、移植到肿瘤中的细胞数量、在肿瘤微环境中的生长因子和炎症性细胞因子种类等因素[20]。

在本研究中，笔者将人脑胶质瘤细胞U251于体外培养于人hMSCs的条件培养基中，发现相对于培养于对照培养基的U251细胞，前者的生长增殖更加旺盛，MTT实验结果显示细胞的增殖能力明显提高，差异有统计学意义。hMSCs的条件培养基于体外可促进脑胶质瘤细胞的增殖，其作用机制有待进一步研究，也提示临床工作者应该对hMSCs应用于脑胶质瘤治疗的生物安全性问题需引起关注。

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Influence of human bone marrow mesenchymal stem cells on human glioma cells proliferation

ZHU Ru-sen1CHEN Xin-gui2LAN Liu-bo3LI Jin-hong1YANG Fan1
1.Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Guangdong Province,Zhanjiang 524001,China;2.Cancer Center,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Guangdong Province,Zhanjiang 524001,China;3.Institute of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical University,Guangdong Province, Zhanjiang 524023,China

[Abstract]ObjectiveTo detect the influence of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (hMSCs)on glioma cell proliferation and evaluate the biological safety of treating glioma with hMSCs.MethodsThe hMSCs-conditioned medium(hMSCs-CM)was obtained;human glioma cells U251 in the experiment group were cultured in hMSCs-CM,and U251 in the control group was cultured in the basal medium of hMSCs-CM;changes of cell proliferation were detected by MTT assay.ResultsThe results of MTT assay showed that,compared with the control group,the proliferation of U251 of the experient group that cultured in hMSCs-CM increased significantly,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionhMSCs-CM can promote the proliferation of U251,and it is need to pay attention to the biological safety of treating glioma with hMSCs.

[Key words]Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells;Glioma;Gene therapy;Cells proliferation

[中图分类号]R318

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）04（b）-0013-03

（收稿日期：2017-02-27 本文编辑：任 念）

[作者简介]朱汝森（1978-），男，广东清远人，博士，副主任医师，主要从事神经外科临床及研究工作