肖梦杰 肖学成 薛大权▲崔开宇 涂 皓 吴 莹 朱雅莲

湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065

[摘要]目的建立HPLC法测定醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑有关物质的方法。方法采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）为色谱柱，以甲醇-0.077%醋酸铵溶液（20∶80）为流动相A，以甲醇-乙腈（40∶60）为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为225 nm；流速1.0 ml/min；柱温为35℃。结果硝酸益康唑与各杂质分离度良好，硝酸益康唑在0.2～100.0 μg/ml的浓度范围内峰面积与浓度之间呈良好的线性关系，回归方程为y=15.6295x+4.5920（r=0.999 97）。结论此方法测定醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有关物质简单可行。

[关键词]醋酸曲安奈德益康唑乳膏；硝酸益康唑；有关物质；HPLC

醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑为广谱抗真菌药，醋酸曲安奈德为糖皮质激素，醋酸曲安奈德益康唑乳膏对皮炎、湿疹、皮肤细菌感染和皮肤浅表真菌感染伴有明显炎症反应疗效确切[1-9]。由于在曲安奈德益康唑乳膏 （Ⅱ）（醋酸曲安奈德益康唑乳膏）国家标准WS1-（X-320）-2004Z、《中国药典》[10]收录的曲安奈德益康唑乳膏、硝酸益康唑乳膏质量标准中均未对产品的有关物质进行控制，为了更好地提高产品质量，通过醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的杂质研究[11-13]，并参考EP标准[14]和《中国药典》标准中硝酸益康唑原料药有关物质的检查方法，对醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有关物质进行了控制。

1.1 仪器

KNAUER S-2500高效液相色谱仪（德国诺尔）和相应的工作站；TU-1810紫外-可见分光光度计（北京谱析）；Acculab ALC-110.4分析天平；水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；ORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm× 100.0 mm，3.5 μm）色谱柱。

1.2 试药

醋酸曲安奈德益康唑乳膏样品由武汉诺安药业有限公司试制，批号：20160701、20160702、20160703；空白辅料样品（自制，除不含有硝酸益康唑外，其他成分均与样品一致）；市售醋酸曲安奈德益康唑乳膏（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：15061701，商名品：吉佰芙）；硝酸益康唑对照品（由中国食品药品检定研究院提供，批号：100214-201204，含量为99.6%）；硝酸益康唑系统适用性对照品（由欧洲药典委员会提供，批号：006PA0，含硝酸益康唑和杂质A、B、C）；硝酸益康唑杂质A对照品（由Cato Research Chemicals Inc提供，批号：C3D-2013-1503，含量为98.8%）；硝酸益康唑杂质B对照品 （由Cato Research Chemicals Inc提供，批号：C4X-13272-1501，含量为99.8%）；硝酸益康唑杂质C对照品 （由Cato Research Chemicals Inc提供，批号：C4X-13273-1412，含量为99.7%）。甲醇、乙腈为色谱纯；其他均为分析纯。

2.1 色谱条件

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）为色谱柱，以甲醇-0.077%醋酸铵溶液（20∶80）为流动相A，以甲醇-乙腈（40∶60）为流动相B，检测波长为225 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为35℃；进样量为20 μl，梯度洗脱见表1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 样品溶液 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后立即过滤，取续滤液放置至室温，备用。

2.2.2 对照品溶液 取硝酸益康唑对照品约10 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为硝酸益康唑对照品储备液；取硝酸益康唑系统适用性对照品适量，精密称定，用甲醇稀释成浓度约为1 mg/ml的对照品溶液；分别取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品约10 mg，精密称定，用甲醇分别稀释成浓度约为10 μg/ml的对照品溶液。

2.2.3 空白辅料对照溶液 取空白辅料样品乳膏2.5 g，精密称定，制备方法同“2.2.1”项下。

2.3 专属性考察

取空白溶剂（甲醇）、空白辅料、系统适用性溶液及供试品溶液分别按上述色谱条件进样，进行专属性考察，结果显示溶剂和空白辅料对主峰及杂质的检测均无干扰。表明该流动相用于醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑的有关物质的检测具有一定的专属性，色谱图见图1～4。

2.4 破坏试验

2.4.1 酸破坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密称定，置烧杯中，加甲醇 15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。加1 mol/L的盐酸溶液2.5 ml，摇匀，避光放置2 h后，用1 mol/L氢氧化钠溶液2.5 ml中和，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后立即过滤，取续滤液放置至室温，备用。

2.4.2 碱破坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密称定，置烧杯中，加甲醇 15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。加1 mol/L的氢氧化钠溶液2.5 ml，摇匀，避光放置2 h后，用1 mol/L盐酸溶液2.5 ml中和，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后立即过滤，取续滤液放置至室温，备用。

2.4.3 光破坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。用甲醇稀释至刻度，摇匀，置4500 Lx的强光下照射48 h，然后在冰浴中冷却1 h后立即过滤，取续滤液放置至室温，备用。

2.4.4 热破坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密称定，置烧杯中，加甲醇 15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。用甲醇适量移至25 ml量瓶中，再将量瓶置100℃水浴中破坏2 h（每间隔半小时加甲醇1次）后，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后立即过滤，取续滤液放置至室温，备用。

2.4.5 氧化破坏 取醋酸曲安奈德益康唑乳膏2.5 g，精密称定，置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，使溶解，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷。加入30%的H2O22.5 ml，摇匀，避光放置2 h后，于80℃水浴中加热2 min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在冰浴中冷却1 h后立即过滤，取续滤液放置至室温，备用。

按上述色谱条件，分别取制剂的酸、碱、光、热、氧化破坏溶液进样，记录色谱图，见图5～9，结果表明：①醋酸曲安奈德益康唑乳膏的酸、碱、光、热、氧化破坏溶液进样，各降解产物峰之间、各降解产物峰与主峰之间、各降解产物峰与辅料峰之间的分离度均符合规定；②醋酸曲安奈德益康唑乳膏中硝酸益康唑对光照破坏较稳定，对酸、碱、氧化和高温破坏均敏感，其中，热破坏和碱破坏将制剂中的另一主药醋酸曲安奈德和抗氧剂BHA已完全破坏，破坏后降解产生的物质统一计算为硝酸益康唑热破坏降解杂质。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下同一供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6针。结果，醋酸曲安奈德益康唑乳膏中单个最大杂质峰面积的RSD=0.44%（n=6），各杂质峰面积和的RSD=0.44%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.6 样品溶液稳定性

取“2.2.1”项下同一供试品溶液，放置于25℃恒温箱中，于0、1、2、4、6、8 h后进样测定。结果，醋酸曲安奈德益康唑乳膏中最大杂质峰面积的RSD=0.13%（n=6），各杂质峰面积和的RSD=0.74%（n=6），表明供试品溶液在8 h内比较稳定。

2.7 定量限及检测限考察

取“2.2.1”项下硝酸益康唑对照储备液，逐步稀释，定量限按信噪比10∶1计为0.3 ng，检测限按信噪比3∶1计为0.1 ng。

2.8 重复性试验

取“2.2.1”项下硝酸益康唑对照储备液，连续进样6针，结果，硝酸益康唑峰面积RSD=0.11%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 线性关系试验

取硝酸益康唑对照品储备液，以甲醇为溶剂，分别配制成含硝酸益康唑约为0.2、1.0、2.0、10、100 μg/ml的系列对照品溶液，按上述拟定的色谱条件分别进样，记录色谱图。以硝酸益康唑的平均峰面积为纵坐标，以硝酸益康唑的浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程为y=15.6295x+4.5920（r=0.999 97），结果表明，硝酸益康唑溶液在0.2～100.0 μg/ml的浓度范围内峰面积与浓度之间呈良好的线性关系。

2.10 试制样品与市售样品的有关物质检查

精密称取批号为20160701、20160702、20160703三批样品及市售样品各2.5 g，分别置烧杯中，加甲醇15 ml，置80℃水浴中加热2 min，用甲醇适量移至25 ml量瓶中，放冷，定容，滤过取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照上述确定色谱条件检查，已知杂质按外标法，未知杂质按主成分自身对照法计算其有关物质，结果见表2。

3.1 检测波长的选择

因硝酸益康唑与醋酸曲安奈德的最大吸收波长及色谱条件存在一定的差异，为了更灵敏地检出产品的杂质种类及准确控制杂质的限度，按照两主成分原料药项下的有关物质检查方法分别进行有关物质的检测，硝酸益康唑在200～400 nm的波长范围内扫描，其最大吸收波长为220 nm，参考硝酸益康唑原料药《欧洲药典》标准和《中国药典》标准中有关物质的检测波长为225 nm，所以确定将225 nm作为检测波长。

3.2 杂质的相对保留时间

取硝酸益康唑系统适用性对照品溶液、杂质A对照品溶液、杂质B对照品溶液及杂质C对照品溶液，按上述色谱条件，分别连续进样2针，结果，系统适用性溶液中杂质A、B、C与主峰的相对保留时间分别约为0.3、0.7、0.9，与EP标准中规定的杂质A、B、C与主峰的相对保留时间约为0.2、0.6、1.1不一致。张慧文等[15]研究表明，用不同品牌的C18色谱柱，杂质A、B、C的出峰位置和出峰顺序有可能不同，所以用相对保留时间对杂质A、B、C进行定位不准确。

3.3 杂质的限度

对比硝酸益康唑原料药的《欧洲药典》标准和《中国药典》标准中有关物质的检测方法，在杂质限度控制中，《欧洲药典》标准更严格，在《欧洲药典》标准中分别收载了三个已知杂质，分别为杂质A、B、C，并制定了限度，明确了结构式，而在《中国药典》标准中未进行详细的规定；另外，《欧洲药典》标准中对未知单杂和总杂的限度较《中国药典》标准更严，计算方法均为不加校正因子的主成分自身对照法。考虑到本品为外用制剂，参考《中国药典》结合3批样品和市售样品的检验结果，拟定的杂质限度与硝酸益康唑《中国药典》质量标准一致，即单个未知杂质的限度为0.2%，总杂为0.5%。

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Determination of Econazole Nitrate related substances in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream

XIAO Meng-jie XIAO Xue-cheng XUE Da-quan▲CUI Kai-yu TU Hao WU Ying ZHU Ya-lian
College of Pharmacy,Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China

[Abstract]ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of related substances of Econazole Nitrate in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream.MethodsThe ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm× 100.0 mm,3.5 μm)column was adopted.The mobile phase consisted of a mixture of Methanol-0.077%solution of Ammonium Acetate (20:80)as mobile phase A,a mixture of Methanol-Acetonitrile (40:60)as mobile phase B,which was used as gradient elution.The detection wavelength was 225 nm.The flow rate was 1.0 ml/min,and the column temperature was 35℃.ResultsEconazole Nitrate was well separated from impurity.The calibration curves was linear in range of 0.2-100.0 μg/ml for Econazole Nitrate,the regression equation was y=15.6295x+4.5920 (r=0.999 97).ConclusionThis method is simple and feasible to determine the related substances of Econazole Nitrate in Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream.

[Key words]Triamcinolone Acetonide Acetate and Econazole Nitrate Cream;Econazole Nitrate;Related Substances; HPLC

[中图分类号]R917

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）02（c）-0011-05

（收稿日期：2017-01-02 本文编辑：方菊花）

[作者简介]肖梦杰（1990-），男，湖北枝江人，2014级在读硕士研究生

▲通讯作者：薛大权（1958-），男，本科，教授，从事药物新剂型与新制剂的研究