尹卫华1夏红梅1罗小瑾2▲徐 荣1胡小雄1

1.江西省宜春市人民医院/宜春学院临床学院肿瘤科，江西宜春 336000；2.江西省宜春市人民医院/宜春学院临床学院泌尿外科，江西宜春 336000

[摘要]目的 观察沙利度胺对前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的作用及其IL-6和Cx43表达的影响。方法 将递增浓度6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺加入处于对数生长期的前列腺癌PC3细胞培养。采用MTT法检测不同浓度沙利度胺对PC3细胞的增殖抑制影响，Annexin PI双染色法检测PC3细胞凋亡情况，ELISA法检测PC3细胞中IL-6和Cx43的表达。结果25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺能明显抑制PC3细胞体外增殖，随着时间延长、浓度增加，增殖抑制率相应升高；IL-6表达随沙利度胺浓度增加而下降（r=-0.924，P=0.009），Cx43表达与沙利度胺浓度成正相关（r=0.915，P=0.010）。结论 沙利度胺可通过抑制人前列腺癌PC3细胞IL-6表达、上调Cx43水平，可能恢复细胞缝隙连接通讯功能来抑制肿瘤细胞增殖、诱导其调亡，从而达到抗肿瘤效果。

[关键词]沙利度胺；前列腺癌；白介素-6；连接蛋白43

前列腺癌是目前男性最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，在西方国家，其死亡率位居恶性肿瘤的第2位[1-2]。近年来，我国前列腺癌发病率明显呈上升趋势[3-4]。早期前列腺癌采用去势治疗取得了一定的效果，18～24个月发展为激素非依赖性前列腺癌。目前激素非依赖性前列腺癌缺乏有效的治疗手段，是前列腺癌患者死亡的主要原因。虽然以紫杉醇类为基础的化疗药如多西他赛、卡巴他赛以及新药阿比特龙，Sipuleucel-T疫苗可改善激素非依赖性前列腺癌患者短期生存，但仍然逃脱不了耐药、免疫耐受的问题[5-6]。相关研究显示，前列腺癌进展可能与白介素-6（interleulin-6，IL-6）、连接蛋白 43（Connexin43，Cx43）有关[7-11]。IL-6是具有强烈激发雄激素受体，上调肿瘤细胞VEGF的表达，是前列腺癌进展因素之一[7-8]。Cx43是介导细胞间缝隙连接通讯（gap junctional intercellular communation，GJIC）的蛋白，为肿瘤细胞和血管内皮细胞提供连接途径，GJIC功能受 Cx43的调控；Cx43表达下降，GJIC转移功能低可促使肿瘤细胞的生长和正常细胞的恶性表型转化，在激素非依赖性前列腺癌的细胞生物学行为恶化过程中起决定作用[9-11]。

沙利度胺又名反应停，是一种合成性的谷氨酸衍生物，化学名称是N-（2，6-二氧代-3哌啶基）-邻苯二甲酰亚胺，通过抑制血管增殖、调节机体免疫，从而抑制肿瘤生长，具体机制不清楚。本课题组前期工作提示，沙利度胺能抑制IL-6，上调Cx43，本实验旨在利用体外细胞培养来观察沙利度胺对前列腺癌PC3细胞增殖及其IL-6、Cx43表达的影响，从细胞通讯的角度来探讨激素非依赖性前列腺癌分子机制。

1.1 材料

人雄激素非依赖型前列腺癌PC3细胞株由南方医科大学生物技术学院赠送。纯品沙利度胺购自常州制药厂。DMEM培养基、胎牛血清均购于美国Gibco公司；青霉素-链霉素溶液（100X）购自中国碧云天生物技术公司；IL-6、CX ELISA试剂盒、Annexin试剂盒均购置R&D Systems总公司；流式细胞仪：美国BD公司FACS Vantage产品，使用CellQuest软件系统进行分析。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及增殖试验检测 前列腺癌PC3细胞置于含10%胎牛血清DMEM培养基，37℃5%二氧化碳连续培养，取生长状态良好的PC3细胞，经0.25%胰酶消化，加入96孔板，以5×105个/孔接种到96孔培养板，每孔200 μl。实验分为空白对照组、沙利度胺实验组，实验组均设6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml共5个浓度，每个浓度设5个复孔。细胞呈对数生长期时加药，继续培养48 h后，每孔加入150 μl的MTT试剂（5 g/L），培养4 h，然后弃上清液，加入100 μl二甲基亚砜，震荡15 min。用酶标仪测定492 nm波长处（以630 nm为参考）的各孔吸光度D（λ）值，计算PC3细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组D492 nm/空白对照组D492 nm）×100%。

1.2.2 细胞调亡实验 按上述实验，离心收集各处理组的细胞，按凋亡检测试剂说明步骤行Annexin V与碘化丙啶（propidium iodide，PI）双标染色，上流式细胞仪进行检测。

1.2.3 IL-6和Cx43检测 PC3细胞在培养24、48 h后，3000 r/min，4℃离心10 min，取上清液。按ELISA操作说明书检测Cx43和IL-6蛋白的表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件包对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验和方差分析，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 沙利度胺对PC3细胞增殖的影响

MTT法结果显示，细胞增殖均呈现不同程度的抑制，且随沙利度胺浓度增加、作用时间延长，沙利度胺对PC3细胞的增殖抑制作用逐渐增强，呈明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。不同浓度沙利度胺作用PC3细胞24、48 h后，抑制率由1.3%增至48.6%（图1）。

 

图1 沙利度胺对前列腺癌PC3细胞增殖的影响

2.2 沙利度胺对PC3细胞凋亡的影响

不同浓度沙利度胺作用PC3细胞48 h后，25.00、50.00、100.00 μg/ml组凋亡率分别为（8.02±0.15）、（15.70± 0.23）、（48.10±0.33），空白对照组细胞的凋亡率为（0.01± 0.01），不同浓度的沙利度胺组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

 

图2 不同浓度沙利度胺对PC3调亡的影响

A.空白对照组；B.6.25 μg/ml组；C.12.50 μg/ml组；D.25.00 μg/ml组；E.50.00 μg/ml组；F.100.00 μg/ml组

2.3不同浓度沙利度胺对PC3细胞中IL-6和Cx43表达水平的影响

随沙利度胺作用时间的延长，各实验组Cx43表达均逐渐升高，沙利度胺药物作用浓度最高100.00 μg/ml组表达最早且最明显，而沙利度胺药物浓度最低6.25 μg/ml组表达最不明显。IL-6随沙利度胺浓度、作用时间的延长，表达均逐渐降低，沙利度胺药物作用浓度最高的100.00 μg/ml组表达下降最明显，而沙利度胺药物浓度最低的6.25 μg/ml组表达最不明显。24 h后，100.00 μg/ml组Cx43、IL-6与其他组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；48 h后，25.00 μg/ml组、50.00 μg/ml组、100.00 μg/ml组优于空白对照组（P＜0.05）。PC3细胞Cx43表达量与沙利度胺的浓度成正相关（r=0.915，P=0.010），而IL-6表达与沙利度胺浓度成负相关（r=-0.924，P=0.009）（图3）。

 

图3 沙利度胺对PC3细胞中IL-6、Cx43表达的影响

激素非依赖性前列腺癌进展是多种因素、多步骤导致肿瘤微环境异常[12]，从而引起癌细胞以更恶性的生物行为复发，或获得雄激素非依赖性增殖能力，给临床上治疗带来困境。人Cx43主要通过形成细胞膜间的通道样结构，为肿瘤细胞和血管内皮细胞提供连接途径；Cx43通过细GJIC间接调控肿瘤细胞的生长和正常细胞的恶性表型转化，在前列腺癌进展过程中起一定的作用。研究显示，Cx43为前列腺基底细胞连接通讯点，其介导的GJIC对维持前列腺组织中的细胞稳态、调控细胞生长和分化起关键作用，GJIC功能异常可能会导致细胞的恶性转化；Cx43蛋白在前列腺癌组织中表达及其强度降低，且与前列腺癌恶性程度成负相关，说明癌细胞的GJIC水平普遍下降，导致了上皮细胞异常或不能控制其生长增殖和分化，进而促进了恶性表型的进展[9-11]。此外，IL-6作为炎性因子，参与调控包括前列腺癌在内的多种肿瘤的血管形成、肿瘤发生及转移过程，其机制多与JAK或Stat3信号通路有关。在LNCap细胞中，IL-6通过Stat3途径激活雄激素受体（androgen receptor，AR），上调VEGF表达，从而启动AR介导的基因表达。进一步研究证实LNCap细胞过表达IL-6，可增加前列腺特异性抗原mRNA的表达水平，降低LNCap细胞因雄激素阻断引起的凋亡[13-15]。同时，可诱导癌细胞的上皮细胞-间充质转化发生，与细胞间通讯功能有一定的关系[16-17]，目前机制不清楚。Cx43和IL-6均作用于肿瘤血管内皮细胞，可能使Cx43的羧基端S325与酪蛋白激酶1结合后磷酸化，影响VEGF和IL-6的表达。

沙利度胺作为抗肿瘤血管生成剂之一，能抑制相关血管生成因子如VEGF、bFGF的作用[18]，根据本课题组前期临床经验，在肺癌放化疗应用中具有良好的疗效[19]。本研究提示，沙利度胺作用于PC3细胞48 h后，凋亡率明显高于对照组（P＜0.05），诱导细胞凋亡可能是其抑制PC3细胞增殖的机制之一；同时发现，随着沙利度胺浓度的增加，Cx43的表达增强，与肿瘤增殖明显成负相关；而IL-6的表达量减少，肿瘤增殖也减少。进一步阐明沙利度胺作用前列腺癌的机制，通过上调Cx43和抑制IL-6表达，恢复PC3细胞GJIC的功能来抑制前列腺癌生长。

在长期应用沙利度胺治疗肺癌的病例中，本课题组发现沙利度胺可以抑制IL-6的表达，但其最常见不良反应为心律失常，主要表现为房室传导阻滞和心动过缓[19]。Cx43分布于心房和心室[20]；沙利度胺在肿瘤治疗过程中，可能导致心肌Cx43的细胞缝隙连接的数量并使功能出现异常，引起心律失常，从这一个侧面印证了沙利度胺对Cx43的作用。这提示沙利度胺对IL-6和Cx43作用机制比较复杂，可能通过多条信号通路完成。本实验初步研究沙利度胺对PC3细胞中IL-6和Cx43的表达产生一定的影响，对于其作用机制有待于进一步研究。

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The effects of Thalidomide on the proliferation,IL-6 and Cx43 expression of prostate cancer PC3 cells

YIN Wei-hua1XIA Hong-mei1LUO Xiao-jin2▲XU Rong1HU Xiao-xiong1
1.Department of Oncology,People′s Hospital of Yichun City in Jiangxi Province/Clinic Medicine School of Yichun university,Yichun 336000,China;2.Department of Urinary Surgery,People′s Hospital of Yichun City in Jiangxi Province/ Clinic Medicine School of Yichun university,Yichun 336000,China

[Abstract]Objective To observe the effects of Thalidomide on the proliferation and apoptosis of prostate cancer PC3 cells,as well as on the expression of the protein Cx43 and IL-6 in this cells.Methods Thalidomide with different concentrations (6.25,12.50,25.00,50.00,100.00 μg/ml)was added to PC3 cells at the logarithmic growth phase.MTT was used to detect the inhibitory effect of different concentration of Thalidomide on proliferation of PC3 cells,the apoptosis rate of PC3 cells was studied by Annexin V fluorescein isothiocyanate（Annexin PI）double staining with flow cytometry.Enzyme-linked Immunosorbnent assay method was used to detect the expression of IL-6 and Cx43 in PC3 cells. Results Below 25.00,50.00,100.00 μg/ml,Talidomide significantly inhibited the proliferation of PC3 cells in vitro,and the inhibition rate increased with the increase of time and concentration,the expression of IL-6 decreased with the increasing of concentration(r=-0.924，P=0.009),the expression of Cx43 had positive correlation with the concentration of thalidomide(r=0.915，P=0.010).Conclusion Thalidomide can inhibit the expression of IL-6 in PC3 cells,increase the expression levels of Cx43,restore the functional refreshment of gap junction intercellular communication function in prostate cancer PC3 cells for in inhibiting the proliferation of PC3 cells and inducing its apoptosis,in order to inhibit the growth of tumor.

[Key words]Thalidomide;Prostate cancer;Interleulin-6;Connexin43

[中图分类号]R737.25

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）02（b）-0008-04

（收稿日期：2016-12-28本文编辑：方菊花）

[作者简介]尹卫华（1976-），博士，副主任医师，主要从事肿瘤免疫研究

▲通讯作者：罗小瑾（1981-），硕士，副主任医师，主要从事泌尿外科疾病研究